Colóquio de Fitotaxonomia

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1 Colóquio de Fitotaxonomia

2 A biologia molecular na taxonomia
Rui Vidal (FFUL) Filomena Nóbrega (EFN) Ana Monteiro (ISA) Colóquio de Fitotaxonomia Instituto Superior de Agronomia 5 de Junho 2001

3 O início da Biologia Molecular
 Estuda as bases moleculares da vida  Relaciona as estruturas das biomoléculas com as funções específicas que desempenham na célula e no organismo. O início da Biologia Molecular Foi em 1953, com a apresentação do modelo estrutural do DNA por Francis Harry Compton Crick e por James Watson

4 Importância da estrutura do DNA
Suporte universal da informação genética transmitida de geração em geração A estrutura do DNA mostra como acontece essa transmissão

5 Dogma central da biologia molecular
A partir do DNA é sintetizado o RNA e a partir deste sintetizam-se proteínas Dogma central da biologia molecular

6 A estrutura dos genomas vegetais
Genoma nuclear (nDNA) 1,1×106 a 110×109 Kbp dsDNA linear Armazena o material hereditário da célula (DNA) Coordena as actividades da célula Fonte da maior parte dos genes que codificam proteínas A maior parte dos genes são membros de famílias de genes Hereditariedade biparental

7 A estrutura dos genomas vegetais
Genoma mitocondrial (mtDNA) Kbp A estrutura dos genomas vegetais dsDNA circular fechado Maior diversidade dimensional Hereditariedade uniparental Baixos padrões de divergência (muito conservado) Recombinações rápidas Grande variabilidade dimensional

8 A estrutura dos genomas vegetais
Genoma cloroplástico (clDNA ou cpDNA) Kbp A estrutura dos genomas vegetais dsDNA circular fechado O mais utilizado Relativamente estável no tamanho e na ordem dos genes Elevado número de cópias Alguns genes são de evolução lenta e outros de evolução mais rápida Regiões espaçadoras/intrões podem variar entre espécies relativamente próximas ou mesmo entre populações Hereditariedade uniparental: normalmente materna nas angiospérmicas e paterna nas gimnospérmicas

9 Moléculas que caracterizam determinada célula ou organismo
MARCADORES Moléculas que caracterizam determinada célula ou organismo Genética Existência de variação Custo Registo de fósseis Homologia Evolução convergente Morfológicos Bioquímicos Genéticos

10 Marcadores Morfológicos
Marcadores controlados por genes associados a caracteres morfológicos, em geral características fenotípicas de identificação visual Número reduzido de marcadores morfológicos Baixo nível de polimorfismo Somente identificados, na sua maioria, ao nível da planta adulta

11 Fenótipos moleculares resultantes da expressão de um ou mais genes
Marcadores Bioquímicos Fenótipos moleculares resultantes da expressão de um ou mais genes Proteínas Metabolitos secundários Fitoquímica Isoenzimas Proteómica Têm elevado nível de polimorfismo São específicos do ciclo vegetativo das plantas

12 Isoenzimas Múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre numa espécie, como resultado da presença de mais de um gene que codifica a mesma enzima Desempenham a mesma actividade catalítica Podem ter diferentes propriedades cinéticas e ser separadas por processos bioquímicos As enzimas de um mesmo grupo diferem entre si na sequência de aminoácidos que possuem A premissa básica é que diferenças na mobilidade de isoenzimas num campo eléctrico são resultantes de diferenças ao nível de sequências de DNA que codificam tais enzimas Base genética

13 Detecção de marcadores isoenzimáticos
A actividade enzimática é detectada in situ através de reacções de coloração histoquímica, como, por exemplo, a formação de um produto corado e insolúvel, visualizando-se num gel diferentes bandas

14 Utilização de Isoenzimas
Avaliar os níveis de variabilidade genética de populações naturais Estudar o fluxo génico entre populações e processos de hibridação natural Estudo da dispersão de espécies Análise de filogenias Identificação de variedades

15 Regiões de DNA que caracterizam a célula ou organismo
Marcadores Genéticos Regiões de DNA que caracterizam a célula ou organismo Complexidade dos genomas eucariotas Cell and Molecular Biology (Karp, G.)

16 Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA)
Marcadores Genéticos Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA) Basais Não Basais DNA telomérico (nuclear) Regiões codificantes dos rRNAs (rDNAs) Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS) Regiões de expressões genómicas (ETS) Regiões codificantes de isoenzimas e/ou aloenzimas stDNA (satélites) Repetições em série de número variável (VNTR) Elementos transponíveis (TEs)

17 DNAs satélites propriamente ditos
Extra-cromossomais Intra-cromossomais Minisatélites (10-60 bp) Microsatélites (1-5 bp) DNAs satélites propriamente ditos Centrómeros Sequências repetitivas agrupadas ou dispersas ao longo do genoma nuclear

18 Elementos transponíveis (TEs)
Regiões de DNA que podem saltar para outro local no mesmo cromossoma ou para outro cromossoma Classe I Retroposões (retroPns) Classe II Transposões (Tns) Retrotransposões (RetroTns) Intrões do grupo II Plasmídeos mitocondriais de leveduras Autónomos Não autónomos MITE (miniature inverted repeat transposable element)

19 Elementos transponíveis (TEs)
Barbara McClintock Transposição/Transposões Transposões (Tns) autónomos e não autónomos LTIR (long terminal inverted repeat) STIR (short terminal As extremidade do elemento transponível contêm sequências repetidas No local de inserção do transposão há duplicação da sequência alvo Transmissão vertical (estáveis ao longo das gerações celulares) Transmissão horizontal (instáveis) Transposões são específicos para células ou organismos

20 Elementos transponíveis (TEs)
Retrotransposões (retroTns) copia gypsy LINEs SINEs LTR (long terminal repeat) Não - LTR Síntese de um RNA intermédio Transcriptase inversa Promovem duplicação da sequência alvo Agrupados em famílias Não se inserem em genes funcionais Transmissão vertical (estáveis) Transmissão horizontal (poucos casos) Retrotransposões são específicos para a família, géneros, espécies, sub-espécies ou variantes de células ou organismos

21 Elementos transponíveis (TEs)
Retrotransposões (retroTns) copia gypsy LINEs SINEs LTR (long terminal repeat) Não - LTR Síntese de um RNA intermédio Transcriptase inversa Promovem duplicação da sequência alvo Agrupados em famílias Não se inserem em genes funcionais Transmissão vertical (estáveis) Transmissão horizontal (poucos casos) Retrotransposões são específicos para a família, géneros, espécies, sub-espécies ou variantes de células ou organismos

22 Marcadores Genéticos Basais Não Basais
Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA) Basais Não Basais DNA telomérico (nuclear) Regiões codificantes dos rRNAs (rDNAs) Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS) Regiões de expressões genómicas (ETS) Regiões codificantes de isoenzimas e/ou aloenzimas stDNA (satélites) Repetições em série de número variável (VNTR) Elementos transponíveis (TEs) Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS e ETS)

23 Metodologias Físico-Químicas Enzimáticas Clonagem Sequenciação

24 Metodologias Físico-Químicas
Hibridação Electroforese em géis

25 PCR Metodologias Físico-Químicas Hibridação Em solução Suporte sólido
Reacção de polimerase em cadeia Southern blotting (DNA) Northern blotting (RNA) Western blotting (Proteínas)

26 Polimorfismos de DNA amplificados ao acaso
PCR Polimorfismos de DNA amplificados ao acaso (RAPD)

27 Polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados
PCR Polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP)

28 PCR Metodologias Físico-Químicas Hibridação Em solução Suporte sólido
Transferência e fixação de fragmentos de DNA em membranas Em solução Suporte sólido PCR Reacção de polimerase em cadeira Southern blotting (DNA) Northern blotting (RNA) Western blotting (Proteínas)

29 Polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição
Southern blotting Polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP)

30 Metodologias Físico-Químicas
Electroforese em géis AGE PAGE Ribotipia Normal PFGE Unidimensional (1-D) Bidimensional (2-D)

31 Electroforese AGE

32 Electroforese PAGE (1-D)

33 Electroforese PAGE (2-D)

34 PCR Metodologias Enzimáticas Sequenciação Clonagem Via celular
Via química Amplificação PCR Enzimática Celular Reacção de polimerase em cadeia Clonagem

35 Selecção do tipo de marcador mais apropriado
Características do marcador Isoenzina RFLP RAPD AFLP Sequenciação Reprodutibilidade ++ +++ Facilidade técnica + Tempo de desenvolvimento curto médio Custos do equipamento baixo alto Custos dos ensaios baixo médio Adequação para análise filogenética média muito alta

36 Selecção do tipo de marcador mais apropriado
Parâmetros de decisão Nível de informação da diversidade Nível de variação esperada ou indicada Acessibilidade de sondas e "primers" Tempo necessário ao desenvolvimento do ensaio Investimento operacional e financeiro

37 Selecção do tipo de marcador mais apropriado
Classificação biológica Reino Divisão Classe Ordem Família Género Espécie Regiões de DNA codificante de rRNAs Regiões de DNA codificante de proteínas Regiões de DNA não codificante

38 Biologia Molecular no Século XXI
Genómica Proteómica

39 Acumulação exponencial de sequências
Genómica Análise global, via informática, dos genomas e dos genes a partir das sequências depositadas em bancos de dados, tendo em vista o rastreio e a elucidação dos mais variados marcadores e "sinais" que controlam as expressões génicas como também a estrutura e a organização dos genomas Actualmente o GenBank contém registados mais de 11 biliões de bp de cerca de espécies Acumulação exponencial de sequências

40 Genómica Genómica Funcional Genómica Estrutural
Tecnologias já desenvolvidas Genómica Funcional Estudo das funções dos genes e das proteínas Bioinformática Genómica comparativa Genómica Estrutural Estudo das semelhanças e diferenças contidas nas sequências de genomas diferentes ou das proteínas por estes codificadas FISH "Fluorescence in situ hybridization" Fibras de DNA "Chips" de DNA

41 Genómica Estrutural A elucidação das organizações dos genomas fomentou o conceito de que só as proteínas, ou seja, os produtos expressos dos genomas, é que são os elementos responsáveis pela viabilidade das células Mais importante Estudar o conjunto total das proteínas (proteoma) que são expressas num determinado período de vida das células e dos organismos

42 Proteómica Proteómica de Expressão Proteómica Quantitativa
Estuda e detecta as mudanças globais da expressão génica Proteómica Quantitativa Estuda e detecta o equilíbrio das expressões génicas assim como das alterações induzidas por perturbações Proteómica de Mapeação Celular Estuda e detecta sistematicamente as interacções proteína-proteína Se e quando os produtos génicos proteicos são expressos Qual ou quais o(s) grau(s) de modificação após síntese dos produtos génicos proteicos Quais as concentrações relativas dos produtos génicos proteicos

43 Genómica Proteómica Epigenética Sintenia
Estuda as alterações hereditárias na expressão génica sem que ocorra qualquer alteração nas sequências genómicas Estudo da ocorrência de 2 ou mais locus conhecidos no mesmo cromossoma, tendo em vista responder a questões de homologia residual entre cromossomas completamente homólogos nas suas origens

44 A importância da biologia molecular na taxonomia de plantas é enorme, com múltiplas facetas e com especial incidência na resolução de algumas situações ambíguas

45 A biologia molecular na taxonomia
Rui Vidal (FFUL) Filomena Nóbrega (EFN) Ana Monteiro (ISA) Colóquio de Fitotaxonomia Instituto Superior de Agronomia 5 de Junho 2001