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PublicouMárcio Alencastre Beppler Alterado mais de 6 anos atrás
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QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
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AMPLIFICAÇÃO
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RT-PCR semi-quantitativa
Diluição seriada do cDNA 1: :4 1:8 1: : : :128 etc...
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Amplificação na maior diluição corresponde a uma
cDNA em concentrações decrescentes 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Amplificação na maior diluição corresponde a uma maior quantidade de cópias do gene na amostra
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SISTEMA DE DETECÇÃO
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SYBR® Green Intercalante de DNA dupla fita Fluoróforo em suspensão
Inespecífico Curva de dissociação ou melting Não permite multiplex
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Curva de dissociação Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação Realizada ao término da termociclagem
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Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia
Sistema TaqMan® Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease Trabalha com sondas que contém fluoróforos Específico Permite Multiplex Não necessita curva de dissociação Sonda: Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia
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R Q 5’ 3’ R 5’ 3’ Q R Q
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R Q R Q
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Características da sonda
Localiza-se de 1 a 5 pb do primer Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers A primeira base não pode ser G (Quencher) Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)
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Condições de Amplificação
Condições Universais para desenho dos oligos: - Amplicon de 50 a 100 pb Conteúdo de GC Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C Condições Universais de Termociclagem: Desnaturação Anelamento e Extensão Uracil-N-Glicosilase Ativação da AmpliTaq Gold
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Terminologia Baseline Fase onde a intensidade de sinal de produto
amplificado ainda não ultrapassa a intensidade da fluorescência encontrada no meio.
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Terminologia Threshold Nível de fluorescência onde a reação é
detectada durante a fase exponencial; linha de comparação entre as amostras Threshold
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Terminologia Cycle Threshold (CT)
Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruza o limiar de detecção (Threshold) Cycle Threshold (CT)
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Terminologia Rn Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva (sinal do ROX). Normalização empregada para corrigir erros de pipetagem
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TIPOS DE QUANTIFICAÇÃO
Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento Músculo Pele Neurônio + + + + + + + + + + + +
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Custom TaqMan® Gene Expression
- Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações. TaqMan® Gene Expression Assays - Kit pronto disponível (genes conhecidos) TaqMan® Endogenous Control - Kit pronto disponível
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CONSIDERAÇÕES FINAIS Custo-benefício Conhecimentos específicos
Validação de resultados Interpretação estatística
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RELATÓRIO: Aplicações diagnósticas de PCR em tempo real ,
genética, oncologia, virologia, parasitologia etc...
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