PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)

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1 PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)
Quantificação de RNA PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)

2

3 Métodos de Detecção de RNA
Northern Blots Hibridização in situ Teste de Proteção de RNAse RT-PCR (qPCR) Microarranjo

4 qPCR Rapidez Sensibilidade Especificidade

5 Confirmação do produto específico
PCR PCR Caixa Preta Eletroforese Confirmação do produto específico

6 PCR em tempo Real

7 Amplificação Visualização da amplificação em tempo Real
PCR Tempo Real Amplificação Visualização da amplificação em tempo Real Curva de Melting

8 Etapas RNA RT PCR Quantificação Iniciadores Iniciadores e/ou sondas
Modelos matemáticos

9 Fases da PCR Desnaturação inicial (95oC – 5’)
Desnaturação (95oC – 15’’ a 1’) Anelamento (50 a 65oC – 1’) Extensão (72oC – 1’) Extensão final (72oC – 10’) Resfriamento (4-10oC - ∞) 30-40 x

10 Equipamentos ABI Prism 7700 iCycler iQ (BioRad)
RotorGene 3000 (Corbett) LightCycler (Roche)

11 Detecção do sinal Fluoróforos Associados a sondas
Intercalados ao produto amplificado

12 Beacons

13 TaqMan

14 Scorpion

15 Syber Green I

16 Desenho do Fragmento Menor que 100 pb Menor fragmento 67 pb
Amplificam com maior eficiência Denaturam com maior facilidade Eficiência da Taq ( pb/sec) Menor fragmento 67 pb

17 Desenho dos Iniciadores
Separando Exons Programas Tamanho pb 5 GC entre 20-70% Tm 58-60oC

18 Quantificação Absoluta Relativa Número de cópias por amostras
Curva padrão Relativa Amostra A tem mais copias que B Normalização (Gene Referência)

19 Quantificação - Conceitos
Visualização da amplificação em tempo Real Threshold Ct

20 Quantificação - Absoluta
Curva Padrão

21 Quantificação - Relativa
Modelos Matemáticos Tratamento Controle. Gene Alvo Gene Alvo Gene Ref Gene Ref DELTA DELTA

22 Quantificação - Relativa
Gene Alvo Gene Referência Controle Controle Tratamento tratamento Pfaffl (2001)

23 Armadilhas Qualidade do RNA Especificidade x Inespecificidade da sonda
Linearidade da RT Analise do dados O threshold

24 Conclusões Rapidez Sensibilidade Especificidade
Limitado pelo alto custo dos reagentes e equipamentos