OPTICON Continuous Fluorescence Detection System

Apresentação em tema: "OPTICON Continuous Fluorescence Detection System"— Transcrição da apresentação:

1 OPTICON Continuous Fluorescence Detection System
Químicas e Aplicações OPTICON Continuous Fluorescence Detection System 3/25/2017

2 Principais Químicas SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan 3/25/2017

3 Revisão Como funcionam essas químicas
Em que etapa da reação o sinal é visto: Denaturação, Anelamento, Extenção Aplicações para cada química 3/25/2017

4 SYBR Green 1 3/25/2017

5 Como funciona? Liga-se ao dsDNA
SYBR Green 1 fluoresce quando na presença de dsDNA G T C A

6 Desnaturação: Não emite Sinal
G T C A SYBR Green 1 não ligado DNA denaturado

7 Annelamento dos Primers: Fluorescência
G T C A

8 Extenção: Fluorescência
Ponto de leitura G T C A SYBR Green 1 ligado ao dsDNA

9 Análise Quantificação da concentração inicial do Template:
SIM Análise de Curvas de Melting: SIM; verificação de produtos únicos, variantes, produtos múltiplos e/ou complexos primer dimer Análise de End Point SIM; Leitura realizada após terminada a amplificação

10 Quantificação de concentração inicial de Template
Maior concentração inicial de DNA, menor número de ciclos necessário para detecção. Usa-se comparação de Controles de DNA contra amostras desconhecidas e obten-se um gráfico. Desconhecido Controle Intensidade de Fluorescência Controle C(T) Número de Ciclos Número de Ciclos 105

11 Análise de Curva de Melting
Identificação do produto por Tm Intensidade de Fluorescência Tm Temperatura

12 Análise de Curva de Melting
Produto não específico Produto de interesse -dI/dT Intensidade de Fluorescência Temperatura Identificação do Produto por perfil térmico, tm - Tm de cada amostra difere pela concentração de GC e pelo comprimento

13 Vantagens do SYBR Green 1
Fácil de usar - Não utiliza probes de difícil desenho Não é sequência-específico - Pode ser usado para diferentes templates Baixo custo Sensível 3/25/2017

14 Desvantagens SYBR Green 1
Ligação a produtos não-específicos Pode inibir a reação à altas concentrações Solução: sistema mais sensível 3/25/2017

15 Molecular Beacons 3/25/2017

16 Como funciona? Probe em forma de alça (hairpin)
Fluoróforo absorvido por um quencher O loop é complementar a sequência alvo Stem é composto de sequências complementares

17 Denaturação: Fluorescência Não-específica

18 Anelamento: Fluorescência
Ponto de Leitura Sequência alvo Stem Loop Fluoróforo Quencher Probe hibridizado

19 Extenção: Sem Fluorescência
Probes não ligados

20 Aplicações Quantificação de Detecção de sequências específicas.
Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms - Sistemas de detecção simples requerem corrida em duplicata

21 Vantagens Alta epecificidade de detecção
- Melhor técnica para detecção de SNP Pode ter custo reduzido quando utilizado para screening do mesmo Target Permite escolha do Fluoróforo

22 Desvantagens Design complicado Específico para um Target Custo elevado

23 TaqMan 3/25/2017

24 Como funciona? Probe Target-específico 5’ Reporter and 3’ Quencher
Complementar a sequência alvo

25 Denaturação: Sem Fluorescência
Sem Hibiridização 5’ 3’ 5’ 3’

26 Anelamento: Sem Fluorescência
Hibridização do Probe 3’ 5’ 3’ 5’

27 Extenção: Polimerização
3’ 5’ 5’ 3’ Não ocorre extensão do probe 3’

28 Extensão: Strand Displacement
3’ 5’ 5’ 3’ Probe desligado no 5’ Reporter pela Taq Polymerase

29 Extenção: Clivagem e Fluorescência
3’ 5’ 5’ 3’ Probe clivado via atividade exonuclease 5’-3’ Taq polymerase.

30 Análise Curva de Melting: NÃO
Não é possível análise de Curva de Melting devido as propriedades do probe Quantificação de concentração inicial de Quantify Template: SIM Análise de End point: SIM

31 Aplicações Deteção e Quantificação de amostras específicas.
Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms - Sistemas de detecção simples requerem corrida dupla

32 Vantagens Alta específicidade - Bom para detecção de SNP
Design menos complicado que Molecular Beacons Custo reduzido quando utilizado para o mesmo Target Livre escolha do Fluoróforo 5’

33 Desvantagens Desenhado especificamente para um target
Não permite análise de Curvas de melting

34 Resumo Química Como Funciona Quencher Detecção do Sinal
Principal aplicação SYBR Green I Liga-se a menor curva do dsDNA Não Qualquer etapa Quantificação e Detecção. Análise de Curvas de Melting Molecular Beacons Probe Hibridização (Hairpin) Sim Anelamento Detecção de SNP Quantificação e Detecção TaqMan Probe Hibridização (5’-3’ Exo) Extenção

35 Real Time PCR DNA Engine OPTICOM 3/25/2017

36 DNA Engine Opticon Especificações: Exitação e detecção Solid state
Capacidade de 96 amostras Single color Dynamic range: 7 Ordens de magnitude Upgradeable Baseado na plataforma PTC-200 Windows NT 3/25/2017

37 DNA Engine Opticon Melhor: Extremamente sensível <5nM Fluorescein
Grande dynamic range Baseado em tecnologia já existente Não utiliza partes móveis Pequeno tamanho Upgradeable Gradiente Baixo custo: $35,000 3/25/2017

38 3/25/2017

39 Technologia 96 LEDs focados em cada poço/amostra
Cada Poço é exitado individualmente( nm) Detectado por PMT ( nm) Exelente para SYBR Green e FAM 3/25/2017

40 Opticon™ Opticon™ Plataforma DNA Engine™ Unidade Alpha™ 96V
Torre Opticon

41 Plataforma PTC 200 DNA Engine™
Tecnologia de Ponta Referência em termocicladores

42 Unidade Alpha™96V Placas ou Tubos Tampas chatas ou filme

43 Torre Opticon™ Light Emitting Diode (LED) Array
Uso de Fotomultiplicador (PMT) Lentes Fresnel

44 LED Array

45 Fotomultiplicador PMT

46 Lentes Fresnel

47 VVVVVVVVVVVV

48 Opticon™ Baseado em Tecnologia de ponta – PTC 200
Plataforma completa – acompanha computador Design simples – ocupa pequeno espaço Alta sensibilidade – capta < 5nM Fluorescein Manutenção com menor custo Menor preço Assistência técnica já presente no Brasil 3/25/2017