Método Didesoxi de Sanger

Apresentação em tema: "Método Didesoxi de Sanger"— Transcrição da apresentação:

1 Método Didesoxi de Sanger
SEQÜENCIANDO O DNA Método Didesoxi de Sanger Matheus A. Rajão

2 Desenvolvido em 1975, por Frederick Sanger
O DNA é seqüenciado através da produção de fragmentos pela interrupção controlada da replicação enzimática É o método mais usado devido a sua simplicidade Devido a sua extensa aplicabilidade, rendeu a seu criador o Prêmio Nobel de Química de 1980

3 A reação de seqüenciamento é como a reação da PCR
Além dos 4 desoxirribonucleosídeos trifosfatos (marcados com radioatividade) a mistura de incubação contém um análogo 2’, 3’- didesoxi de um deles

4 A incorporação desse análogo bloqueia o posterior crescimento da nova cadeia, pois este não tem a hidroxila 3’ terminal Assim, a ligação fosfodiéster seguinte não é formada

5 Quatro de tais conjuntos de fragmentos com término de cadeia (um para cada análogo didesoxi) são então submetidos à eletroforese. A seqüência de bases deste DNA sintetizado é lida no auto radiograma das quatro colunas.

6 Uma alternativa altamente eficaz à auto-radiografia é a detecção por fluorescência.
Um marcador fluorescente é ligado a um primer, cada um com uma cor diferente em cada umas das misturas de término de cadeia. (ex: azul para término em A e vermelho para término em C) As misturas de reação são combinadas e corridas juntas na eletroforese, por onde passa um feixe de laser. As faixas separadas de DNA são, então, detectadas por sua fluorescência à medida que emergem do gel.

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8 Em um gel podem ser corridas até 96 amostras de uma só vez.
Na figura ao lado temos um fragmento de um gel real. As quatro cores representam os quatro nucleotídeos. Se essa imagem estivesse em tamanho real, teria 4 metros de altura e 30 cm de largura

9 Seqüenciador ALF

10 Imagem do gel no monitor do seqüenciador

11 Seqüenciador Mega Bace