Genética Geral II Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza

Apresentação em tema: "Genética Geral II Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza"— Transcrição da apresentação:

1 Genética Geral II Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza
Depto de Genética – UFPR

2 PCR Reação em Cadeia da Polimerase
Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas Aplicações: seqüenciamento de genes diagnóstico de doenças hereditárias testes de paternidade e na medicina forense diagnóstico de doenças infecciosas

3 PCR Reação de PCR: DNA dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos)
iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão

4 PCR Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos

5 Desnaturação Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. As amostras são aquecidas a ºC durante um a vários minutos.

6 Hibridação A temperatura é reduzida a ºC durante alguns segundos. Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde

7 Extensão Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos.
A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores

8 PCR animação

9 PCR – desenho dos iniciadores
Comprimento: em torno de 20 bases GC: ideal em torno de 50% Software para desenhar iniciadores:

10 PCR – desenho dos iniciadores

11 PCR-RFLP Enzima de restrição:
mutação cria sítio de restrição mutação elimina sítio de restrição Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese

12 PCR-RFLP

13 PCR-RFLP ALA Seqüência normal....5'..GAA GCA GAA TGG.....GCA GG...3' Iniciador (3') GT CGT ACC.....CGT CC Produto da PCR '..GAA GCA GCA TGG '  Fnu4HI ou BsoFI  ____________85 pb__________'________21 pb_________

14 PCR-RFLP 85pb 106pb UU UK KK

15 PCR-RFLP Vantagem: rapidez
Desvantagem: algumas enzimas tem digestão parcial

16 PCR-SSCA (ou SSCP) Análise de Conformação de Fita Simples
Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). DNA é amplificado por PCR Depois é desnaturado por calor Gel de poliacrilamida não desnaturante As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e correm em posições diferentes no gel. Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).

17 PCR-SSCA Padronização da técnica  vários fatores
Relação bisacrilamida x acrilamida Concentração de acrilamida Tampão do gel  pH Tempo de corrida Temperatura de polimerização Temperatura da corrida

18 PCR-SSCA

19 PCR-SSCA

20 Seqüenciamento didesoxi
Método de Sanger Síntese de DNA na presença de nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3’-hidroxila. Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese

21 Seqüenciamento animação

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24 PCR em tempo real É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese.

25 PCR em tempo real

26 PCR em tempo real SYBR Green
é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador. Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado Um aumento da fluorescência é observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contínuo da reação

27 PCR em tempo real SYBR Green

28 PCR em tempo real Taqman

29 PCR em tempo real

30 PCR em tempo real Aplicações Quantificação Detecção de carga viral
Determinação do número de cópias de um gene Análise da expressão gênica

31 PCR em tempo real Exemplo de aplicação:
Investigação de amplificação ou deleção dos genes BCHE e ACHE em tecido mamário tumoral com relação ao tecido normal.

32 PCR em tempo real Quantificação relativa TumorCHE / Tumor18S
SangueCHE / Sangue18S

33 PCR em tempo real Gene BCHE

34 Genotipagem com Taqman

35 Homozigoto para o alelo marcado com FAM

36 Heterozigoto

37 Homozigoto para o alelo marcado com VIC

38 Genotipagem

39 FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs2863381
Fonte: Alves, 2009

40 FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495
Fonte: Alves, 2009