TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium

Apresentação em tema: "TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium"— Transcrição da apresentação:

1 TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium
VETORES UTILIZADOS PARA Agrobacterium Esquema dos sistemas de vetores de Agrobacterium para transformação de plantas - a) Co-integrados - cis - b) Vetores binários - trans (Brasileiro e Dusi, 1999).

2 seqüência de direcionamento
rrnB T2 seqüência de terminação de transcrição rrnB T1 seqüência de terminação de transcrição sítio do Primer M13 Forward attL1 (fita complementar) TOPO® sítio de reconhecimento 1 “Overhang” TOPO® sítio de reconhecimento 2 attL2 sítio do Primer M13 Reverse Gene de resistência à canamicina Origem de replicação pUC Asc I Not I TOPO CCCTT CACC ATG NNN NNN TAC NNN NNN AAGGGT TTCCCA Not I Asc I GGGAAGTGG TOPO att L1 T1 T2 att L2 pENTR/D-TOPO® 2.6 kb pUC ori canamicina

3 TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA de TABACO
1. Purificação do vetor pENTR-D TOPO de E. coli . 2. Recombinação com o vetor Gateway pK7WG2D: sítio de clonagem entre o promotor e terminador 35S o gene marcador de resistência à canamicina TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA de TABACO

4 TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA de TABACO
2. Transformação genética de Agrobacterium tumefaciens por meio de eletroporação plasmídeo Ti desarmado Região de virulência Gene de interesse Extremidades do T-DNA TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA de TABACO 3. Seleção de clones transformantes em meio seletivo

5 Transformação de Tabaco Padrão de segregação gênica
Horsch et al., 1985 Padrão de segregação gênica Planta T2 Homozigota

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7 Análise dos Transformantes via PCR
Primers do gene nptII, de resistência à canamicina 1kb ~700pb 

8 Análise das Plantas de Tabaco EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO “SOUTHERN BLOT” “Q-RT-PCR” ANÁLISE QUÍMICA

9 Southern Blot

10 Hibridização Marcação da sonda
Hibridização

11 Southern Blot R1 LB R2 npt II SONDA RB cDNA gene ugdh

12 Análise de Southern Blot

13 Northern Blot

14 Q-RT-PCR Fluorescência comparativa das reações de Q-RT-PCR a partir do cDNA das linhagens de tabaco selvagem (WT) e transgênicas, utilizando-se primers específicos para o transgene e primers específicos para um gene controle (referência) de expressão constitutiva e uniforme (ex: ubiquitina) de tabaco.

15 Nível de Transcritos Nível comparativo de transcritos do gene endógeno das plantas de tabaco controle (WT) e do gene (endógeno+exógeno) das transgênicas (1-6), realizado a partir da reação Q-RT-PCR.

16 Análise Fenotípica das Plantas
WT CG Fenótipo das linhagens de tabaco transgênicas homozigotas (1-6) relativo às linhagens controles: selvagem (WT) e transgênica Gateway (CG), 6 semanas após germinação.

17 Análises Químicas + Serragem Extrator Soxhlet Caule Moinho Willey
HPAE –PAD Cromatógrafo de Íons Parede Celular + Extrativos (Carboidratos) Espectrometria (Lignina solúvel) L-Arabinose, D-Galactose, D-Glicose, D-Xilose e D-Manose (Sigma®)