Técnicas de Biologia Molecular:

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1 Técnicas de Biologia Molecular:
Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Disciplina: Genética Molecular Técnicas de Biologia Molecular: Microarrays, CGH, Análise Serial da Expressão Gênica - SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e iRNA Prof. Eleonidas Moura Lima

2 Construção de Sondas P32 Texto xerox

3 Nylon cDNA Expression Arrays
Texto xerox

4 Construção de Sondas EM à λ 550 nm (Verde) EM à λ 649 nm (Vermelho)
Texto xerox EM à λ 649 nm (Vermelho)

5 Microarrays Texto xerox

6 Análise de Microarrays
Texto xerox

7 Análise de Microarrays

8 CGH (Hibridação Genômica Comparativa)

9 CGH (Hibridação Genômica Comparativa)

10 CGH (Hibridação Genômica Comparativa)

11 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
TAGS ou ETIQUETAS Seqüências pequenas Exclusivas de um determinado gene NÃO SE REPETEM EM OUTROS GENES 10 pares de bases Banco de dados grande e validado

12 SAGE • TAGS de 10 pb - identificam unicamente um transcrito
• TAGS ligados uns aos outros facilitam clonagem e seqüenciamento de todos os transcritos da amostra • Depois, os tags são separados e identificados através de seus sítios de reconhecimento CATG O método de SAGE foi descrito em 1995 por Velculescu e colaboradores e baseias-se em três afirmações: Fragmentos pequenos de 10 pb, denominados tags, próximos à extremidade 3’ são suficientes para identificar unicamente um gene ou transcrito, sendo que estes tags são depositados em bancos de dados para comparações. Os tags podem ser ligados uns aos outros, formando fragmentos grandes ou concatâmeros, que facilitam muito a clonagem e sequenciamento dos tags presentes na amostra. Posteriormente, os tags podem ser separados novamente, porque são intercalados por sítios CATG, e então relacionados aos seus genes correspondentes através da comparação com bancos de dados de tags. Velculescu et al, 1995

13 SAGE INOVAÇÕES E VANTAGENS • Análise em série • Grande escala
• Identificação de um número maior de genes • Transcriptoma completo de uma célula • Custo e tempo menores • Quantificação da expressão gênica (contagem dos tags)

14 SAGE: método Obtenção do mRNA e do cDNA Como obter estes TAGS?
Com o RNA total é feita a separação do RNA mensageiro através da ligação da cauda poli-A a esferas magnéticas acopladas a oligonucleotídeos T, e o RNAm é capturado aproximando o tubo de uma bandeja magnética. Este RNAm é utilizado como molde para a transcrição reversa e então o DNA complementar é obtido.

15 SAGE: método Digestão com a enzima-âncora, NlaIII
O passo seguinte é digerir o cDNA gerado com a enzima-âncora, NlaIII, e são separados fragmentos que vão desde a cauda poli-A até o primeiro sitio da enzima, CATG.

16 SAGE: método B A amostra é dividida em 2 tubos:
Neste ponto, a amostra é dividida em dois tubos e a cada uma das alíquotas é ligados adaptadores diferentes, denominados A e B. Na seqüência destes adaptadores está presente o sítio de reconhecimento da segunda enzima a ser utilizada e também sítios para primers, para posterior amplificação.

17 SAGE: método A próxima etapa é a formação dos tags, utlizando a enzima BsmFI. Esta enzima De restrição é do tipo IIS, ou seja, tem seu sítio de reconhecimento no adaptador, mas só vai cortar o cDNA 14 pares de bases adiante. Estes 14 pb são suficientes para a gerar o tag de 10 pb e conservar o sítio da enzima-âncora, CATG, na outra extremidade.

18 SAGE: método Adaptador Primer F Primer R Adaptador
Em seguida, a amostra que havia sido dividida em dois tubos é novamente unida, através do uso de enzima ligase, e o produto formado é o chamado ditag de 102 pb, formado pelos adaptadores A e B nas extremidades e por dois tags no centro, separados dos adaptadores por sítios CATG. O produto desta ligação é amplificado utilizando os primers complementares às seqüências dos adaptadores. Após a PCR este produto é purificado.

19 SAGE: método Os ditags são submetidos a nova digestão com NlaIII, para retirada dos adaptadores e obtenção do ditag de cerca de 26 pb. Após a digestão, este produto é purificado.

20 SAGE: método Através de reação de ligação, os ditags de 26 pb são ligados uns aos outros para formar os concatâmeros. Estes, são fragmentos longos de 200 a 1000 pb contendo os conjuntos de ditags.

21 SAGE: clonagem e seqüenciamento
São os concatâmeros que são utilizados para clonagem e sequenciamento.

22 SAGE: análise Separa cada etiqueta Conta as repetições
• SAGE 2000 : extrai os tags Com as sequencias geradas, é feita a extração dos tags através do programa SAGE Este programa retira os sítios CATG, separa os ditags em tags únicos e gera uma lista que contem todos os tags cncontrados na amostra e também o numero de vezes que cada um deles se repetiu. Além disso, cada tag já é anotado, ou seja, relacionado ao gene ao qual ele corresponde. Separa cada etiqueta Conta as repetições Relaciona ao gene correspondente

23 SAGE: análise • Tabela com todos os tags encontrados na amostra
• Os tags são associados aos genes correspondentes • O número de tags para cada gene quantifica a expressão

24 SAGE: análise

25 SAGE • Fornece de forma geral todos os genes expressos
• Permite comparação entre bibliotecas • vários exemplos

26 Técnicas de Biologia Molecular:
Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Disciplina: Genética Técnicas de Biologia Molecular: CGH, Análise Serial da Expressão Gênica - SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e iRNA Eleonidas Moura Lima

27 Histórico (1998) – Andrew Fire e Craig Mello (Caernohabditis elegans) – Silenciamento de específicos genes através da intodução de um RNA dupla-fita (dsRNA); (PTGS) – Silenciamento Gênico Pos-Transcricional em plantas Mecanismo natural de defesa a vírus e transposons Controle do desenvolvimento: mutantes com desenvolvimento anormal Controle do transcriptoma celular

28 C. elegans e o RNA dupla fita(dsRNA)
WT Controle mex-3B dsRNA Antisense dsRNA Hibridação in situ Nature (1998) 391:806

29 “Interferência por RNA (RNAi)”
O dsRNA como ativador Ingestão ou injeção de RNA dupla fita em C. elegans era mais eficaz utilizando dsRNA para silenciar genes de interesse do que o RNA antisense “Interferência por RNA (RNAi)”

30 RNA de interferência “Processo recentemente descoberto que pode regular a expressão de genes endôgenos” RNA de interferencia é uma forma de silenciamento pos transcricional no qual uma fita dupla de RNA induz degradação de um transcrito cuja sequencia é homóloga.

31 Mecanismo de ação do RNAi
RNA dupla fita atua como molécula ativadora RNA dupla fita é processado gerando siRNAs siRNAs servem de guia para a degradação específica do RNA alvo RNA alvo é degradado devido à homologia de sequência com o siRNA

32 Alta especificidade com o RNA alvo
O siRNA atua como guia de reconhecimento Alta especificidade com o RNA alvo X siRNA 21-23 nt dsRNA mRNAs celulares

33 um fosfato 5’ terminal (siRNA)
Ativação - Dicer Cliva o dsRNA deixando um fosfato 5’ terminal (siRNA)

34 Dicer 19-21 nt duplex 2 nt 3’ overhangs
Endonuclease - RNase do tipo III

35 (RNA-induced silencing complex) Endonuclease cliva somente na
Execução - Complexo RISC (RNA-induced silencing complex) Complexo ribonucleoprotéico composto por siRNA mais diversas outras proteínas incluindo membros da família Argonaute ( atividade dependente de ATP) Endonuclease cliva somente na região de homologia

36 Dicer e RISC

37 Amplificação - RdPR Em plantas e C. elegans - Ação da RNA polimerase dependente de RNA (RdRP) Amplificação via atividade da RdRP Clivagem

38 Em plantas e C. elegans - Ação da proteínas transportadoras
Sinalização Sistêmica Em plantas e C. elegans - Ação da proteínas transportadoras Célula a célula e por longa distância

39 Waterhouse et al. Nature (2001) 411, 834-842.
Sinalização Sistêmica Waterhouse et al. Nature (2001) 411,

40 Caracteríticas Efetivo em baixo número de cópias e altamente específico Manutenção e persistência Efeito rápido e eficaz

41 Relevâncias da técnica de RNAi
Silenciamento gênico específico Silenciamento éxon-específico ou alelo-específico Silenciamento de família multigênica

42 Aplicação práticas na área médica
Pode ser utilizado em terapias gênicas; Genes deletérios altamente expressos (doenças neuro-degenerativas e neoplasias malignas); Atenuar acúmulo de produto de genes defeituosos (esclerose e Alzheimer)

43 Conclusão Cada vez mais o RNAi vem sendo utilizado em aplicações médicas e científicas, consolidando-se como uma poderosa ferramenta de bloqueio gênico.

44 Técnicas de Biologia Molecular:
Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Disciplina: Genética Molecular Técnicas de Biologia Molecular: Microarrays, CGH, Análise Serial da Expressão Gênica - SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e iRNA Prof. Eleonidas Moura Lima