Fernando do Amaral Braga Daniele Ares Cavalcante

Apresentação em tema: "Fernando do Amaral Braga Daniele Ares Cavalcante"— Transcrição da apresentação:

1 Identificação de espécie em produtos cárneos por meio da utilização do PCR
Fernando do Amaral Braga Daniele Ares Cavalcante Jaqueline Aguiar Rodrigues Olivia Kim

2 Por quê? Garantia de qualidade do produto a ser consumido;
Combate a fraudes (diferenciação e identificação em produtos cárneos); Garantia para judeus , árabes e seus descendentes (não consumo de carne suína); Aspecto legal; Alimentação animal (sanidade – BSE). Alimentação humana (risco)

3 Técnicas para identificação de espécies
Métodos que se utilizam de análises de proteínas: Cromatografia líquida; Imunoenssaio; Técnica eletroforética.

4 Desvantagens: Perda da atividade biológica (com a morte do animal);
Características dependentes do tipo celular; A maioria é termoinstável.

5 Para a identificação da espécie, a análise de DNA é preferível quando comparada à das proteínas, pois: Mais rápido, mais específico, mais sensível, simples e utiliza o DNA ( que não degrada no processamento).

6 DNA genômico DNA mitocondrial - número grande de mitocôndrias por célula, e de moléculas de DNA por mitocôndria e se conservam pelas gerações (mãe – filho)

7 PCR: detecção de presença de DNA em carnes cozidas e não cozidas, linguiças, comida enlatada, produtos curados, patês e rações.

8 Identificação de DNA suíno em produtos cárneos Calvo et al (2001)

9 Amplificação não específica usando primers não específicos;
Corrida em gel de agarose; Excisão da banda mais intensa; Sequenciamento; Verificação;

10 Desenho do par de primers:
5’ GGATCCGGCATTGCCGTTAG- 3’ (forward) 5’ GTCTTTTTTTGCCATTTCTTGG-3’ (reverse) Amostras contendo : 0; 0,001; 0,005; 0,01; 0,1; 1; 2; 5; 10; 25; 50; 75 ou 100% de carne suína; Amostras cozidas e cruas e de patês de pato; Três experimentos: 20, 25 e 30 ciclos de amplificação.

11 Resultados e discussão
30 ciclos de amplificação: detectou-se até 0,005% de DNA suíno em misturas contendo carne bovina; 25 ciclos: detectou-se 0,1%; 20 ciclos: detectou-se 1%.

12 Nas 200 amostras de DNA de diferentes espécies, não foi obtida amplificação positiva; (1- bovino; 2- ovino; 6- suíno;4-frango; 10- controle negativo; 11- marcador)

13 Amostras cozidas e não cozidas: mesma sensibilidade (incluindo as misturas autoclavadas).

14 Voltando às vantagens…
Sensibilidade: com 30 amplificações, detectou-se 0,005% de DNA suíno; Rápido: com 20 ciclos, detectou-se 1% em poucas horas.

15 Identificação de Foie Gras de Ganso e de Pato Mula Rodríguez et al

16 Introdução Foie Gras (ganso ou pato) Prato tradicional de luxo
Ganso: mais apreciado e mais caro  FRAUDES

17 Identificação e diferenciação de espécies
MÉTODOS: Diferenças morfológicas e sensoriais Métodos Analíticos – Proteínas Métodos Imunológicos Métodos Analíticos – Ácidos nucléicos

18 Método analítico – ácidos nucléicos
Extração do DNA (concentração estimada pela absorbância a 260nm) Amplificação por PCR do gene 5S rDNA - primer forward 5S1 (5’TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’) - primer reverse 5S2 (5’-CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’)

19 Eletroforese em gel de agarose

20 Excisão de bandas para purificação e sequenciamento do produto amplificado
Desenho de primers específicos - primer reverse (pato) 5SD: 5’-CCGCAAAAGCCCCCC-3’ - primer reverse (ganso) 5SG: 5’-TCTTCCCCACACCTGCACC-3’ - primer forward (ambas espécies) 5S3: 5’-CGGAAGCTAAGCAGGGTCG-3’

21 Amplificação por PCR Multiplex de fragmentos específicos do gene 5S rDNA

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23 Resultado e Discussão Primers 5SD e 5S3: amplificação de um fragmento de 106 pb (pato) Primers 5SG e 5S3: amplificação de um fragmento de 171 pb (ganso)

24 Não houve distúrbios decorrentes do uso dos 3 oligonucleotídeos durante a reação de amplificação
Anelamento específico dos primers à sua respectiva amostra de DNA, na sua sequência alvo Os mesmos resultados foram apresentados por amostras submetidas à pasteurização e esterilização

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26 Identificação de DNA específico de Bovino em rações
PAVEL KRCMAR and EVA RENCOVA

27 Objetivo: testar a aplicabilidade do PCR como um método de rotina na detecção de carne e osso bovino no concentrado oferecido na nutrição do gado Analisou-se 30 amostras de concentrado de diferentes distribuidores da Rep. Tcheca

28 DNA mitocondrial (porção 3’ do RNAt para lisina, subunidade 8 da ATPase e porção amino-terminal da subunidade 6 da ATPase) Primer forward (L8129): 5’- GCCATATACTCTCCTTGGTGACA – 3’ Primer reverse (H8357): 5’- GTAGGCTTGGGAATAGTACGA – 3’ Fragmento amplificado de 271pb

29 Especificidade do primer: suínos, ovinos, equinos, coelhos e frangos - sem amplificação
Eletroforese de 5 amostras de concentrado com diferentes porcentagens de osso e carne bovina (0,125; 0,25; 0,5; 1 e 2%), apresentando um padrão de migração e intensidade característicos - qualitativo

30 Pegou-se 2 porções de cada amostra e 2 PCRs foram feitos para cada porção. Os resultados só foram validados se os 4 PCRs fossem idênticos. 10% das amostras tiveram 0,5% de material bovino O procedimento descrito é adequado para testar a presença de DNA bovino em rações comerciais

31 Identificação de material Bovino em alimentos processados e não- processados por PCR JORGE H. CALVO, CLEMENTINA RODELLAR, PILAR ZARAGOZA and ROSARIO OSTA

32 DNA genômico: região satélite (1709) com 84pb
Primer forward 5’ – CAGAACTTGAATTTATTTG – 3’ Primer reverse 5’ – GTGACGACAGTGTACTGTTC – 3’

33 Especificidade do primer: 45 amostras de sangue de 8 diferentes raças de gado e 125 amostras de outras espécies Sensibilidade: amostras de mistura de carne bovina e suína cruas e cozidas contendo 0,001% a 100% de carne bovina e ração contendo de 0,001% a 100% material bovino Análise qualitativa

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37 Estabelecimento e aplicação da PCR-RFLP fluorescente para identificação de carne Bovina, Caprina e Suína YU-LUNG and CHICH-SHENG LIN

38 Amostras de suíno, bovino e caprino
DNA mitocondrial – 12S RNAr Primer forward 5’ – GCCAGCCACCGCGGTCA – 3’ Primer reverse 5’ – CTTACCTTGTTACGACTTGC – 3’

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40 RFLP – Alu I, Dde I e Rsa I

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43 PCR-RFLP fluorescente – dCTP marcado

44 Avaliar misturas de carnes - semiquantitativa

45 Jerilyn A. Walker and David A. Hughes
Identificação quantitativa de DNA espécie-específico através de PCR – INTRA SINE Jerilyn A. Walker and David A. Hughes

46 Amostras de vaca, cavalo, ovelha, antilope, cachorro, gato, coelho, porco, veado, pato, rato e camundongo Par de primers: bovinos, galinha, suínos e ruminantes (veado, ovelha e antilope) – região intra -SINE SINE – região não repetida que se repete ao longo do DNA

47 Primer forward de bovino
5´-TTTCTTGTTATAGCCCACCACAC -3´ Primer reverse de bovino 5´-TTTCTCTAAAGGTGGTTGGTCAG-3´ Primer forward de suíno 5´GACTAGGAACCATGAGGTTGCCG3´ Primer reverse de suíno 5´- AGCCTACACCACAGCCACAG – 3´

48 Primer forward de galinha
5´-CTGGGTTGAAAAGGACCACAGT-3´ Primer reverse de galinha 5´-GTGACGCACTGAACAGGTTTG-3´ Primer forward de ruminantes 5´-CAGTCGTGTCCGACTCTTTGT-3´ Primer reverse de ruminantes 5´- AATGGCAACACGCTTCAGTATT-3´

49 PCR amplicon: - 98pb – Bovino (1.711B bovine repeat) - 134pb – Suíno (PRE-1 SINE) - 169pb – Galinha (CR1 SINE) - 100pb – Ruminantes (Bov-tA2 SINE)

50 PCR-RT (real time) – quantificação do DNA amplificado e de misturas de bovino, galinha e suíno
Syber Green – se liga entre as moléculas de DNA e fluoresce – barato e inespecífico Taqman – sonda com duas extremidades (report e quencher) que se liga ao DNA e fluoresce – caro e específico