Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento Marluce Aparecida.

Apresentação em tema: "Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento Marluce Aparecida."— Transcrição da apresentação:

1 Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento Marluce Aparecida Assunção Oliveira Bióloga, Especialista em Microbiolgia Especialista em Gestão Institucional - MBA Mestre em Ciências Biológicas - Microbiologia Doutoranda em Ciências da Saúde - Infectologia e Medicina Tropical Chefe do Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas Fundação Ezequiel Dias - LACEN/MG

2 Antígenos versus Anticorpos
Leptospira spp.

3 Resposta imune a Leptospira spp.
Sorovar específica Resposta predominantemente humoral (anticorpos). Antigenicidade Atígenos de superfície (LPS); Compartilhamento de antígenos. 3

4 Evolução da resposta humoral (anticorpos)
10 semana 20 semana 30 semana 40 semana meses anos Escala de tempo Concentração de anticorpos IgM IgG Diagnóstico sorológico Fases Bacteremia Imunidade Bacteriuria Isolamento e PCR (adap. Royal Tropical Institute, Netherlands) 4

5 Diagnóstico Laboratorial
1ª fase da doença ou fase leptospirêmica ( dias). Cultivo. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 2ª fase da doença ou fase imunogênica ( dias). Pesquisa em campo escuro. MAT (Teste de aglutinação microscópica). ELISA (Ensaio imunoenzimático). PCR (Reação em cadeia da polimerase).

6 CULTURA

7 Cultura de Leptospira spp.
O isolamento de leptospiras depende do material biológico de escolha e do tempo de evolução da doença.

8 Cultivo de Leptospira spp.
Meio líquido Meio semi-sólido

9 Hemocultura Exame qualitativo
Fase de leptospiremia: primeiros 10 dias de doença  antes do início da antibióticoterapia; Coleta em condições assépticas; 1,2 e 3 gotas de sangue total em três respectivos tubos; Incubação 28-30oC / abrigo da luz / aprox. 4 meses; Acompanhamento semanal por microscopia de campo escuro. 5 mL meio de cultura semi sólido

10 MICROAGLUTINAÇÃO

11 Sorovares e cepas - Microaglutinação.
Meio líquido

12 Triagem - Exame qualitativo.
Leitura após incubação. Preparo da lâmina para visualização das reações de cada sorovar/paciente Leitura microscópica

13 Visualização microscópica
Sem aglutinação 25% aglutinado 50% aglutinado 75% aglutinado 100% aglutinado Microscopia de campo escuro (leitura): 13

14 Titulação - Exame quantitativo
CN = 100 l PBS + sorovar a ser titulado. 100 l soro diluído 1: l sorovar a ser titulado. CN 100L 1:25.600 Hardjo Icteroh. Autum. Patoc Wolffi Astralis Canic. 1:100, 1:200, 1: Soro 1709 Taras.

15 ELISA - IgM

16 ELISA-IgM para o diagnóstico de leptospira
Fase sólida com antígeno ou anticorpo mobilizado; conjugado (ante imunoglobulina humana ligado a uma enzima); adição do substrato; formação de cor; leitura por espectrofotometria (determina a relação entre a intensidade da cor e a quantidade do que está sendo medido).

17 ELISA - exame qualitativo

18 Perfil de reatividade - MAT e ELISA-IgM
Numero de soros positivos/2009 14,4% 36,1% 22,3% 17,2% 7,8% 2,2% 

19 Perfil de reatividade ELISA - IgM reagente e MAT ≥ 800.
ELISA - IgM reagente e MAT reagente ≤ 800. ELISA - IgM reagente. ELISA indeterminada e MAT reagente ≤ 800. ELISA indeterminada. ELISA - IgM não reagente e MAT reagente ≤ 800 (IgM e IgG).

20 MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM
ELISA IgM Sensibilidade 100% ELISA IgM Especificidade 86 % ELISA IgM Valor Preditivo Positivo 71% ELISA IgM Valor Preditivo Negativo

21 MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM
ELISA IgM Sensibilidade 99,5% (IC 95% 98,0-100,0%) ELISA IgM Especificidade 90,0% (IC 95% 88,5-91,5) ELISA IgM Valor Preditivo Positivo 74,5% (IC 95% 66,7-80,9%) ELISA IgM Valor Preditivo Negativo 99,8% (IC 95% 99,1-100%) Concordância ,3% (IC95% 89,6-94,4%).

22 Amostras com diagnóstico diferencial

23 N= 127 (R-11; I-2; NR-114)

24 ELISA- IgM BIOMANGUINHOS x MAT
DO CO ELISA MAT DF 9 0,429 0,261 REAGENTE andamana1/200; ballum1/100; shermani1/400; tarassovi1/400; FEBRE MACULOSA IgM: IFI REAGENTE 3 0,636 0,224 andamana1/200; australis1/100; ballum1/100; bratislava1/100; sejroe1/100; hardjo1/100; icterohaemorrhagiae1/100; patoc1/100; tarassovi1/800 HEPATITE C (ANTI-HCV): ELISA REAGENTE 23 0,183 0,163 NÃO REAGENTE LEISHMANIOSE VISCERAL : IFI REAGENTE 14 0,299 FEBRE MACULOSA IgG: IFI REAGENTE 0,2 IN: curso da doença; DO: leitura do teste; CO ponto de corte; DF: diagnóstico diferencial.

25 Conclusões Baseado no VPN : o método de ELISA - IgM é um bom método para triagem de amostras de pacientes com suspeita de leptospirose diminuindo assim o número de amostras examinadas pelo método de microaglutinação . É necessário a realização da microaglutinação para todas as amostras que apresentarem resultados indeterminado ou reagente na ELISA - IgM. Quando expandido o intervalo entre inicio de sintomas e data de coleta, verificamos maior sensibilidade da ELISA - IgM, assim, todo amostra coletada antes de 10 dias de curso da doença deverá ser encaminhada 2ª amostra após uma semana da data da coleta da 1ª.

26 Diagnóstico de Leptospirose - Lacen MG (desde 2011)
-Todas as amostras (soro) de pacientes com suspeitas de leptospirose são analisadas (triadas) pelo método ELISA-IgM. -Somente as amostras (soro) que apresentarem resultados indeterminado ou reagente quando analisadas pelo método de ELISA-IgM serão analisadas pelo método de Aglutinação Microscópica (MAT). -Amostras (soro) de pacientes com um mês ou mais de início de sintomas serão processadas as duas metodologias, ELISA-IgM e MAT. EI

27 Sempre que possível ofereça flores.
Obrigada Diagnóstico de Leptospirose (desde 2011) Todos os laudos que apresentarem resultados não reagente para leptospirose constarão apenas a descrição do resultado do ELISA-IgM, os que apresentarem resultados indeterminados ou reagente pelo método de ELISA-IgM constarão da descrição dos resultados do ELISA-IgM e MAT. Todas as amostras (soro) devem ser encaminhadas juntamente com a ficha SINAN, e a data de coleta e início de sintomas são informações fundamentais para a análise dos resultados laboratoriais, portanto, de preenchimento obrigatório. EI Sempre que possível ofereça flores.