Terapia Génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento

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1 Terapia Génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento
Encontro de Ciência em Portugal Fundação Calouste Gulbenkian Lisboa, 12 e 13 de Abril de 2007 Terapia Génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento Luís Pereira de Almeida Departamento de Vectores e Terapia Génica Head: Mª Conceição Pedroso de Lima

2 Estratégias de administração para o sistema nervoso central
Terapia génica in vivo Transplantação de células Terapia génica ex vivo Células encapsuladas Vectores virais Bombas osmóticas But the problem is: how can we deliver these proteins in the brain? Access to the brain through systemic circulation is severely limited by the presence of the blood brain barrier and the short half-life of proteins in the systemic circulation. The alternative is localized delivery in the brain. For this we can either use pumps or polymeric systems that slowly delivery the recombinant protein in the brain, or we can use encapsulated cells that we previously engineer to produce the protein of interest. These cells are then inserted into a semipermeable device that can be implanted in the desired region. Or we can simply graft these modified cells by simple injection in the region of interest. Or finnally we can directly modify the cells of the central nervous systems in order to allow these cells to produce the protein of interest and for this we use genetic vectors. For this purpose, we were particularly interested in lentiviral vectors. Mas aqui põe-se o problema, como administrar estas proteínas no cérebro? O acesso ao cérebro encontra-se severamente limitado pela presença da barreira hemato-encefálica e o curto tempo de meia-vida destas proteínas na circulação sistémica. A alternativa é uma administração localizada no cérebro. Para isso podem utilizar-se bombas ou sistemas poliméricos que são modificadas por engenharia genética de forma a produzirem a proteína desejada. Estas células são em seguida inseridas num dispositivo semipermeável que pode ser implantado na região desejada. Ou podemos simplesmentetransplantar estas células modificadas na região pretendida. Ou finalmente podemos modificar directamente as células do sistema nervoso de forma a que estas produzam a proteína pretendida e para isto recorre-se ao uso de vectores genéticos. Para este efeito estávamos particularmente interessados nos vectores lentivirais. Sistemas poliméricos Aebischer and Ridet TINs; 2000 LPAlmeida

3 Transferência de genes com vectores lentivirais
LTR GAG PRO POL VIF VPR VPU NEF ENV TAT REV HIV-1 Terceira geração - Seguros Sem capacidade de replicação Transdução de células que não se dividem Neurotropismo Expressão prolongada Ausência de resposta imunitária PGK GAG RRE SA SD y LTR SIN Transgene WHV Genoma do vector Célula alvo LPAlmeida

4 200 000 a 300 000 células com o gene de interesse
Transferência de genes para diferentes regiões do sistema nervoso central do rato SN estriado Medula espinal a células com o gene de interesse LPAlmeida

5 Doença de Huntington (CAG)n huntingtin gene 8-29 normal 67 exões 200 kb - cromossoma 4 Gene da Huntingtina >40 Doença de Huntington Neurónios Gabaérgicos transcrição Huntingtina - 350kDa tradução NH2 Movimentos involuntários descoordenados, demencia, depressão, psicose morte anos após manifestação Sem terapia Modelos transgénicos com neurodegeneração, quando existente, muito ligeira striatum A doença de Huntington é uma doença genética, é causada por uma mutação no gene da huntingtina. Neste gene há uma repetição do trinucleótido CAG, que codifica a glutamina. Pessoas que tenham mais de 40 repetições do trinucleótido CAG irão desenvolver a doença algures no decurso das suas vidas. Este gene é transcrito e traduzido numa proteína de função em larga medida desconhecida que vai provocar uma degeneração selectiva dos neurónios GABAérgicos espinhosos de dimensão média, numa região específica do cérebro, o estriado. Os doentes densenvolvem coreia, psicose, depressão e demencia. A morte ocorre 15 a 20 anos após a manifestação da doença. LPAlmeida

6 Vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas
Gene mutado vector lentiviral 1 5’LTR Promotor Gene da doença 3’ LTR 2 Produção de vectores lentivirais 4 Modelos animais Injecção no cérebro 3 - Doença de Huntington - Doença de Machado-Joseph - Doença de Parkinson - Doença de Alzheimer LPAlmeida

7 Produção de um modelo da doença de Huntington utilizando vectores lentivirais
Huntingtina mutante 50 µm 100 µm controlo 19 Q Ausência de agregados de huntingtina Ausência de lesão neuronal 0.5mm Agregados de huntingtina Lesão neuronal Huntingtina mutante 82 Q Vectores Huntintina mutante Vectores controlo transgene transgene Injecção estereotáxica no cérebro do rato LPAlmeida

8 Utilização de vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas
Novos modelos genéticos Transponíveis para outras espécies Estudo dos mecanismos moleculares da doença in vivo Avaliação de terapias

9 Taroni F & DiDonato Nat Rev Neurosci. 2004 Aug;5(8):641-55
Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 ou doença de Machado Joseph (CAG)n n= 61 a doença n= normal gene da ataxina-3 14q32.1 gene SCA3/MJD1 transcrição Ataxina 3 42 kDa translação NH2 Doença neurodegenerativa Maior incidência em Portugal (Ilha das Flores) Principal sintoma: ataxia - descoordenação dos movimentos musculares voluntários Taroni F & DiDonato Nat Rev Neurosci Aug;5(8):641-55 LPAlmeida

10 sequências para silenciamento ataxina-3 mutante
Nova estratégia para o tratamento da doença de Machado-Joseph silenciamento da expressão da ataxina-3 mutante com vectores lentivirais Ataxina mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante Ataxina mutante + sequencias controlo AGCAGCAGGGGGACCTATC shAtax wt T C A G TCGTCGTCCCCCTGGATAG AGCAGCAGCGGGACCTATC shAtax mut T C A G TCGTCGTCGCCCTGGATAG

11 Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante
Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32 1H9 DARPP-32 Dupla marcação Ataxina-3 mutante + sequencias controlo Ataxina-3 mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante 1H9 DARPP-32 Ausência de agregados e de perda de DARPP-32 3 semanas LPAlmeida

12 Vectores lentivirais: plataforma tecnológica de administração no Sistema Nervoso Central
Gerar novos modelos animais de doenças do Sistema Nervoso Central Validar alvos terapêuticos Terapia génica para o Sistema Nervoso Central Terapia/validação de alvos moleculares Modelos de doença LPAlmeida

13 Agradecimentos MIRCen
Nicole Déglon Philippe Hantraye Emmanuel Brouillet Raymonde Hassig Nöelle Dufour Veronica Colomer Johns Hopkins School of Medicine, USA Sebastian Kugler Gottingen University, DE MIRCen Patrick Aebischer Ruth Luthi-Carter Étienne Regulier Philippe Colin Valérie Perrin Sandro Alves Isabel Ferreira Ana Luísa Carvalho Conceição Pedroso Lima Sérgio Simões João Nuno Moreira

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22 Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante
Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32 1H9 DARPP-32 Dupla marcação Ataxina-3 mutante + sequencias controlo Ataxina-3 mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante 1H9 DARPP-32 Ausência de agregados e de perda de DARPP-32 3 semanas LPAlmeida

23 Vectores lentivirais que expressam RNAs curtos de cadeia dupla permitem silenciar a expressão da ataxina-3 mutante envolvida na doença de Machado-Joseph- potencial interesse terapêutico

24 Lentiviral-based Model of Huntington’s disease in adult rats
Agregados de huntingtina transgene transgene Lesão neuronal Vectores Huntingtina mutante Vectores controlo Huntingtina mutante 82 Q 50 µm 100 µm controlo 19 Q Huntingtina In the first set of experiment to validate this approach, we have used the shortest huntingtin fragment coding for the first 171AA with 19/82CAG. This construct has already been used to produce transgenic mice therefore providing a baseline of what we can expect in vivo. The recombinant viruses, deficient for replication, were produced and injected in the striatum of adult rats. The WT construct in the left side and the mutated fragment of Htt with 82 CAG repeats in the right side. The animals were sacrificed at 1, 2, 4, 8 and 12 weeks post-injection and the brains processed for immunohistochemistry with huntingtin, ubiquitin Abs, and the neuronal markers. NeuN, DARPP32, ChAT, and NADPH-d. 0.5mm de Almeida et al. (2002) J. Neurosci. 22: