Prof.Doutor José Cabeda

Apresentação em tema: "Prof.Doutor José Cabeda"— Transcrição da apresentação:

1 Prof.Doutor José Cabeda
Métodos Celulares Prof.Doutor José Cabeda

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Células Sanguíneas Prof.Doutor José Cabeda

3 Prof. Doutor José Cabeda
CD4 Células do S.I. T CD8 B Linfócitos NK Macrofagos Monócitos Neutrófilos PMN Eosinófilos Basófilos Outras células do Sangue plaquetas eritrócitos Prof. Doutor José Cabeda

4 Purificação de células do sistema Imunológico
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5 Cell Separation Technologies
Centrifugation : Density Filtration : Size Flow Cytometry (FACS) Size Granularity Fluorescence Batch affinity systems : antibody, avidin-biotin Batch magnetic systems Paramagnetic difference Prof. Doutor José Cabeda

6 Separação em gradiente de densidade
Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentar Ficol: polisacarideo Agrega eritrócitos tornando-os mais densos Metrizamida (composto denso contendo iodo) Densidade ajustável em função da concentração Prof. Doutor José Cabeda

7 Separação em Gradiente descontínuo de densidade
Soro plaquetas PBMC Ficoll-hypaque density Prof. Doutor José Cabeda

8 Separação em gradiente contínuo de densidade (II)
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9 Separação Imunomagnética
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10 Immunomagnetic Labeling of Cells
Magnetic bead Target antigen FITC Antibody (IgG) PBL HER-2/neu Cell Cell One-Step Labeling Two-Step Labeling Prof. Doutor José Cabeda

11 Paramagnetic particles
Large size 1 to 5 um in diameter Magnetic susceptibility of a cell: High Small number of beads per cell 1- 10 beads/cell Commercially available Prof. Doutor José Cabeda

12 Paramagnetic colloidal beads
Colloidal size 50 to 200 nm Spread in solution (Brownian Motion) Magnetic susceptibility of a cell: Low Large number of beads per cell ,000 beads/cell Prof. Doutor José Cabeda

13 Molecular Magnetic Labeling
Erbium ion (Er3+) Paramagnetic ion High atomic magnetic dipole moment Ionic binding to the cell surface Ferritin Paramagnetic protein Hollow protein shell (13 nm) Deposition of Fe2O3 the cavity (7 nm) Prof. Doutor José Cabeda

14 Prof. Doutor José Cabeda
Magnetic Labeling Prof. Doutor José Cabeda

15 Cell Separation Based on Antigen Expression Level
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16 MACS® Cell separation system
Plunger Separation column Magnet Remove the magnet magnetic cell non-magnetic cell Unlabeled cells Immunomagnetically labeled cells Prof. Doutor José Cabeda

17 HG4100® Cell Separation system
Resuspension Aspiration Incubation magnetic cell non-magnetic cell Prof. Doutor José Cabeda

18 Quadrupole Magnetic Flow Sorter (QMS)
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19 High Gradient Magnetic Separator (HGMS)
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20 Cell Separation by the QMS
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21 Lymphocyte cell separation by the QMS
CD8+ cells CD4+ cells 38% 26% 38% Feed Feed a b a b 6% 96% 6% 12% 99% Prof. Doutor José Cabeda

22 CD34 cell isolation by the QMS
Feed a 0.02% 0.67% 88.5% b Total cell load = 2 x108 cells; CD34 cell recovery = 81%; Throughput = 1.75 x 105 cells/s Prof. Doutor José Cabeda

23 Colony Formation from CD34+ Cells
CFU-Mix CFU-GM (immature) BFU-E Prof. Doutor José Cabeda

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PANNING Aderência celular a uma superfície sólida Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados Panning directo Panning indirecto Prof. Doutor José Cabeda

25 Purificação positiva e negativa
Panning Imuno-separação magnética Centrifugação gradiente densidade Centrifugal elutriation Formação de rosetas Citometria de Fluxo Purificação Negativa Todos os anteriores Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento Prof. Doutor José Cabeda

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Rosetas Nos anos 70 Linfócitos T formam rosetas com SRBC Melhor rendimento se: SRBC tratados c/ neuraminidase SRBC tratados c/ AET (2-aminoethylisothiouronium bromide) Método barato mas pouco prático e de baixo rendimento Prof. Doutor José Cabeda

27 Método de lise mediada pelo complemento
Selecção negativa de células Passos: Marcação das células a eliminar c/ anticorpos Indução da lise celular c/ complemento de coelho Prof. Doutor José Cabeda

28 Selecção negativa c/ L-LME
L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado nos lisosomas originando um metabolito tóxico Colocando as células em contacto c/ L-LME, os monócitos e NK são destruídos Separar as células mortas com lymphoprep Prof. Doutor José Cabeda

29 Isolamento de linfócitos de orgãos linfóides secundários
As células estão fracamente agregadas São separáveis por acção mecânica Forçar o tecido a passar repetidamente por uma malha de aço fino Utilizar a suspensão celular obtida, depois de purificada por lymphoprep Descartar os restos de tecido Prof. Doutor José Cabeda

30 Prof.Doutor José Cabeda
Análise de Células Prof.Doutor José Cabeda

31 Estudo de populações celulares por Citometria de fluxo
Utilização de CD14/CD45 para definir a população de linfócitos Prof. Doutor José Cabeda

32 Efeito de um “gating” correcto
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33 Estudo de activação linfocitária (I)
Método de Activação Antigénio especifico pouco útil para culturas de linfócitos humanos Requer activação in vitro para enriquecimento prévio Mitogénio Concanavalina A (ConA) Phytohemaglutinina (PHA) Proteina A de staphylococcus Pokweed mitogen Anticorpos / Interleuquinas Células T aCD3 aCD2 aCD28 aTCR Células B aIgM aCD20 T+B Ionoforo A23187 Ionomicina Ester de forbol IL-2 IL-4 Prof. Doutor José Cabeda

34 Estudo de activação linfocitária (II)
Radioactividade 3H-dTTP (Incorpora-se no DNA em cada divisão) Bromo desoxi-uridina (BrdU) Incorpora-se no DNA em cada divisão É Fluorescente  Detectável por Citometria de fluxo Medida da [Ca2+] intracelular O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da activação celular Prof. Doutor José Cabeda

35 Medida da actividade citotoxica
Incubação das células alvo (linhas tumorais) com 51Cr Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell mediated citotoxicity) as células alvo devem estar sensitizadas com anticorpo Incubação das células alvo com as NK/LAK Medida da radioactividade libertada no sobrenadante da cultura a=lise experimental cpm (efector + alvo) b=lise espontânea cpm (meio+alvo) c=lise máxima (SDS+alvo) Prof. Doutor José Cabeda