Orientador: José Miguel Ortega

Apresentação em tema: "Orientador: José Miguel Ortega"— Transcrição da apresentação:

1 Orientador: José Miguel Ortega
Programa de Pós-Graduação em Genética/UFMG Estudos de domínios reguladores de transcrição de proteínas Tead com novas tecnologias genéticas Erica Maria de Queiroz Orientador: José Miguel Ortega Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento

2 Introdução As proteínas Tead domínio TEA (90% conservado) estrutura 3D homologia: camundongos (Tead1, 2, 3, 4) galináceos (TEF-1A, B, C e D) Drosophila (SD) Aspergilus nidulans (Aba A) leveduras (TEC-1) TEA 68 aa estrutura 3D não conhecida

3 4 parálogos (camundongos):
Introdução 4 parálogos (camundongos): expressão estágios embrionários: pré-implantação/ final adulto Proteínas mTead: Função no desenvolvimento: mTead1 (,  e ) coração/ músculo mTead2 neurônios/ rins mTead3 placenta/ músculo/ coração / pulmões/ rins/ intestino mTead4 (4a e 4b) pulmões/músculo esquelético Isoformas beta e gama de tead1 se diferem da alfa devido a 11 substituições de aa ou inserções no final do domínio TEA devido a splicing alternativo. As proteínas Tead são expressas em uma grande variedade de tecidos.

4 especificidade de ativação e repressão de diferentes genes
Introdução especificidade de ativação e repressão de diferentes genes interações com outras proteínas Proteínas: Função: Referências: YAP co-ativador transcricional DePamphilis et al., 2001 Max fosfoproteína nuclear Gupta et al., 1997 TBP proteína de ligação a TATA box Jiang et al., 1996 TONDU/hVgl-1, hVgl-2 e hVgl co-ativadores transcricionais Vaudin et al., 1999 MEF fator de transcrição de soro Stewart et al., 2002 SRF fator de transcrição de miócito Gupta et al., 2001 PARP modificador de histonas Ordahl et al., 1999 P160 (SRC1,TIF2 e RAC3) co-ativadores nucleares Parker et al., 2000 No entanto, existe sobreposição de expressão das proteínas Tead em muitos tecidos o que nos leva a acreditar que a especificidade de ativação e repressão de diferentes genes por essas proteínas pode estar relacionada a interações com outras proteínas. Regulado por fosforilação e concentração de cálcio nuclear.

5 A proteína mTead1 Introdução 99% de homologia a Tead1 humana
domínios caracterizados PROMOTOR PROMOTOR 52 NAD - - - TEA +++ PR STY ZF 134 236 342 426 Rodrigues, 2001

6 Objetivo Geral Desenvolver e aplicar tecnologias genéticas para o estudo de domínios reguladores da transcrição gênica utilizando proteínas Tead como modelo

7 Objetivos Específicos
Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido Objetivos Específicos Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido Triagem de uma biblioteca de cDNA de embrião de camundongo de 7 dias utilizando PR e ZF como “isca” Aplicar nova tecnologia de análise de alteração da proliferação celular para verificar a atuação de mTead4 na regulação do ciclo celular

8 Metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido

9 Proteína 2 Proteína 1 DA DL Gene Repórter HIS3 UASGal
Sistema de Duplo-Híbrido Proteína 2 DA Proteína 1 DL Gene Repórter HIS3 UASGal mRNA

10 Interações detectadas com o sistema de Duplo-Híbrido
Proteínas: Referências: SNF1 / SNF4 Fields et al., 1989 Proteínas cinases de SNF1 Yang et al., 1992 SRF / SAP1 Dalton et al., 1992 RAP1 / RIF 1 Hardy, 1992 C-jun / c-fos Katoet al., 1992 Maize B / maize C1 Goff et al., 1992 HIV gag / ciclofilina A e B Luban et al., 1993 Max / Mxi 1 Zervos et al., 1993 Rb / proteína fosfatase tipo 1 Durfee et al., 1993 Ras / Raf van Aelst et al., 1993 p53 / antígeno-T Li & Fields, 1993 Grb2 / Sos1 Chardin et al., 1993 várias proteínas hélice-alça-hélice Standinger et al., 1993 DBF4 / CDC7 Jackson, 1993 Mostrando que este sistema tem sido amplamente utilizado

11 Seleção em Meio Líquido
A Proposta Modelo Deepwell Seleção em Meio Líquido Modelo Erlenmayer A nossa pesquisa vem propondo que a seleção em meio líquido pode ser realizada através de 2 modelos: deepwell e/ou erlenmayer. O que nós pretendemos provar é que a escolha de um determinado modelo deve estar diretamente relacionada ao objetivo em questão que pode ser: a presença de clones variados ou de um clone em específico (o mais forte).

12 Seleção em meio líquido
Transformação em Leveduras 108células/ml 0,5.107células/ml Inóculo Transformação com LiAc trp leu Seleção Seleção em meio líquido não transformantes transformantes duplo-híbrido positivo -trp –leu -his 3AT -trp -leu n X 104 transformantes <1 “duplo-híbrido” Seleção em meio sólido

13 Seleção em Meio Líquido: Elaborando o Protocolo

14 Metodologia largeT p53 Elaborando o protocolo Gal4DL-p53 (1 g)
Adição de Gal4DA-largeT 0 ng 0,1 ng 1 ng 10 ng 100 ng largeT GAD p53 GBD Gal4DL-p53 (1 g) GAD + Gal4DA (1 g)

15 Metodologia Os 4 experimentos dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 -trp –leu
-trp –leu -his -trp –leu –his 0,1mM 3AT 0,5mM 3AT 1:10 1:100 OD (1+1+1) Transformação 1:10 1:100 OD (2+1+1) (2+1+2) 1:10 1:100 OD (3+1+1) 1:10 1:100 OD

16 Resultados Preliminares

17 transformantes em placa
1+1+1 Resultados Preliminares transformantes em placa 0,5 0,8 44,5 119,3

18 transformantes em placa
2+1+1 Resultados Preliminares transformantes em placa 0,5 0,8 44,5 119,3

19 transformantes em placa
2+1+2 Resultados Preliminares transformantes em placa 0,5 0,8 44,5 119,3

20 transformantes em placa
3+1+1 Resultados Preliminares transformantes em placa 0,5 0,8 44,5 119,3

21 Sumarizando O protocolo Transformação 1° dia 3° dia ON 30°C 4° dia
Diluição 1:10 3° dia ON 30°C Diluição 1:100 4° dia ON 30°C OD =600 nm 5° dia

22 Seleção em Meio Líquido: Modificando o Protocolo

23 Metodologia Modelo Deepwell Transformações Gal4DL-p53 Gal4DA
100 ng Gal4DA-largeT 4,36l 21,8l 43,8l Gal4DL-p53 Gal4DA 100 ng Gal4DA-largeT 436l Gal4DL-p53 Gal4DA 10,9 ml –trp –leu -his 1 ng 0 ng 5 ng 10 ng

24 4 placas grandes = 1 deepwell
Metodologia Modelo Deepwell Gal4DA-largeT Gal4DL-p53 (1 g) + Gal4DA (1 g) 0 ng 1 ng 5 ng 10 ng controle Modelo Deepwell 4 placas grandes = 1 deepwell

25 Resultados Preliminares Modelo Deepwell
% poços com crescimento % 22 setores em placas [pTD1] (ng)

26 transformação, diluições com seleção em 3-aminotriazol
Perspectivas Modelo Erlenmayer pGBT9, pVA3, pVA3* + pTD1 - p53 p53mut transformação, diluições com seleção em 3-aminotriazol 1 pVA3 : 3 pVA3* enriquecimento pVA3

27 Perspectivas p53 p53mut amplicon Construção GBD-p53 GBD-p53mut GBD
Proteína p53 p53mut Interação forte fraca não

28 Isolamento de mutantes do domínio N-terminal de mTead1

29 Proteína CAN1 / LacZ UASGal MORTE / AZUL
Sistema de Mono-Híbrido Reverso Proteína GBD No sistema de mono-híbrido reverso que nós estamos utilizando, existem 2 genes repórteres: L-can e LacZ. CAN1 / LacZ UASGal mRNA MORTE / AZUL

30 compete? plasmídio 100% Sobrevivência domínio ativador? GBD?? 0,2%
Não = GBD Domínio ativador GBD compete? Sistema L-can Sim = domínio ativador plasmídio 100% Sobrevivência domínio ativador? GBD?? 0,2% [L-can] Starling, 2000

31 X Gal4p Proteína Gene Repórter LacZ UASGal
Ensaio de Competição contra Gal4p inteira Gal4p mais expressa = cor azul pCL1 (Gal4p) + Competidor (contém GBD) Co-transformação (repórter LacZ) GBD competidor mais expresso = Leveduras brancas (domínio ativador mutado, GBD não) Gal4p GAD GBD Proteína GBD X Gene Repórter LacZ UASGal

32 Relação entre plasmídio competidor X pCL1 (Gal4p) e porcentagem de colônias azuis em ensaio com X-gal 80% 62% 29% Gonçalves, 2003

33 Metodologia L-canavanina Sistema de Mono-Híbrido Reverso A seleção
Gene repórter = transportador de L-arginina/L-canavanina (tóxica) A seleção N-terminal mTead1/4 GBD 105 células/ml meio seletivo L-canavanina Transformação YJOZcanR -w -ura ON 30°C colônia individual

34 Obrigada!