Interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa

Apresentação em tema: "Interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa"— Transcrição da apresentação:

1 Interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa
Dr. Abelmon Gesteira DCB/UESC

2 Interaction cacao-Crinipellis
Crinipellis (Cp) Basidiomiceto Fase patogênica e saprofitica Sintomas Desenvolvimento anormal dos caules e flores Formação de vassouras Infecção dos frutos Conseqüências Econômicas Sociais Ambientais

3 Interação cacau-Cp: os sintomas

4 Bibliotecas de cDNA das interações compatível e incompatível
Objetivo: Monitorar comparativamente a expressão diferencial de genes resultantes interação cacau-Cp Acessos utilizados - TSH1188 (resistente)  RT - Catongo (susceptível)  SP

5 Plantas cultivadas em casa de vegetação (Ceplac)
Inoculação e cultura controladas (mistura de esporos, spray, umidade,…) basidiósporos/mL

6 Sintomas e pontos de coleta
Plantio 24h, 48h, 72h 5 DAI Inoculação (30d) Catongo

7 Extração de RNA: um novo método

8 Extração de RNA de cacau
rRNA 5S rRNA 18S rRNA 28S RNA extraído dos diferentes pontos de coletas de TSH e Catongo Pool de RNA 24h, 48h, 72h Cada 5 DAI 70 dias Plantio Inoculação (30d)

9 Confecção das bibliotecas
Smart Creator Kit (Clontech)

10 Características das bibliotecas
Vector sequences and sequences of low quality were eliminated. b The singletons present in each library independent of other lib raries. The percentage was calculated as number of singletons/nu mber of sequences analyzed from the library. c TC = tentative contig . The contigs present in each library independent of other libra ries. d The unigene set for each library is the sum of singleton plus c ontigs for the library. e The mean size of the unigene sequences. f The redundancy of each library calculated as 1 - (unigene library/number of sequence analyzed). g The unigenes (singletons+contigs) specific to the library. The percentage wa s calculated as (library specific /unigene total). h The percentage contribution of specific to each library as a percentage of total . 2. Statistical analysis of the cocoa Cp libraries 29.3 46.8 Contribution (%) 52 58 46 Redundancy 1207 (42) 1719 (54) Unigene 2585 1065 (37) Singletons 6884 3790 3355 Sequences generated 2230 347.5 341 6024 Total 859 (71.2) 354 142 2852 (87) SP 1371 (79.7) 115 3172 (88) RT Library specific unigene (%) Mean size of the sequences analyzed Library 2926 1520 (48) 3271 3613 199 TC The cocoa-Cp interaction libraries show a high library specificity (79.7 and 71.2%).

11 Distribuição dos ESTs por contig
RT and SP libraries are represented by and , respectively.

12 ESTs as mais abundantes
Library TC N° de ESTs in TC (%) Putative function of the gene family Species Expected Size (bp) 74 41 Unknown function homologue to Orf107a Arabido psis thaliana 2.10 - 27 521 9 37 Metallothionein like protein Betula platyphylla 6.10 26 651 19 32 Seed protein homolog to trypsin inhibitor Theobroma cacao 93 929 112 28 Pathogenesis related protein 4b Oryza sativa 1.10 34 1058 184 13 Proline rich protein Gossypium hirsutum 5.10 10 76 12 Ribosomal RNA 18S Poncirus trifoliata 0.0 893 60 Unknown function 6 .10 22 386 Petuniaxhybrida 16 489 20 No hit 829 RT 42 Dehydrin Vaccinium corymbosum 618 144 669 49 Arabidopsis thaliana 266 29 3.10 535 141 Ankyrin repeat family protein 625 103 24 495 57 Ankyrin repeat family protein 7.10 7 505 1 8 4 494 132 Putativ e copper chaperone 631 38 Nuclear factor 1 Mus musculus 447 52 Homo sapiens 497 SP 124 499

13 Comparação com outras bibliotecas de cacau
Venn diagram showing the distribution of the sequences present in cacao libraries. a. From Verica et al., b. From Jones et al., 2002.

14 Outros genes de interesse
Resistência/defesa: quitinases, HPRP, proteina rica em leucina, PRs, Bax inhibidor, U-box, cistatina, glucanase PCD/necrose: superoxide dismutase, oxalato oxidase, proteínas relacionadas a senescência, proteases, proteasoma 26S Parede celular: expansin, celulose sintase, peroxidases Detoxificação: transportador ABC, proteína de reparo Hormônios: proteína regulada por auxina, proteína reprimida por auxina, Fatores de transcrição: myb fator, WRKY, bzip Transdução: receptor kinase, calmodulina, MAP kinase Outros: Formato deshidrogenase, acido cafeico, glicerol aciltransferase, diacilglicerol kinase, transportador de sacarose

15 Poucas diferenças quantitativas com relação a classificação dos genes
RT SP Poucas diferenças quantitativas com relação a classificação dos genes

16 Estudos funcionais de genes de interessem
Glicanase Proteases Factor de transcription WRKY Bax Inhibidor (regulador de morte celular) PR 10

17 Estudo funcional da PR10 Clonagem em vetor de expressão (pET28a)
Expressão em bacteria pLysBl21 Purificação da proteina em coluna His-Tag

18 Estudo funcional da PR10 Teste de atividade anti-fungica (Cp)
Em pseudo-colonias (Freitas et al. 2005) Com 10 ug de PR10 Controle PR10 10 ug

19 Screening da biblioteca BAC Colaboração com o Cirad
Estudos de promotores; Sondas: 27 cDNA interação cacao-Cp; Identificação de 21 clones BACs; sub-clonagem e sequenciamento de promotores.

20 Estudos de expressão / Arrays Colaboração com o Cirad
PCR de todos ESTs de cada biblioteca de cDNA Confeção dos macroarrays (Nylon) Hibridização com sondas Catongo e TSH Projeto en andameto

21 Tese Defendidas Dahyana Santos Britto. Estudos funcionais de genes que codificam proteínas PR ( Pathogenesis Related Proteins) expressas em theobroma cacoa em resposta ao ataque de crinipellis perniciosa Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz,. Orientador: Abelmon da Silva Gesteira. Stênio Carvalho Santos. Caracterização de hidrofobinas do fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, Causador da Doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo Joci Neuby Alves Macêdo. Caracterização funcional do indutor de necrose de Crinipellis perniciosa EM Theobroma Cacao L f. Dissertação (Mestrado em Mestrado Em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo

22 Tese em Andamento Braz Tavares da Hora Junior. Determinação de genes envolvidos na resistência do cacau ao Crinipellis perniciosa via arrays. Início: Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC, Orientador - Fabienne Micheli Heliana Argolo Santos Carvalho. Estudo funcional de genes envolvidos na interação cacau-Crinipellis. Início: Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador – Fabienne Micheli Livia Santos Lima. Mapeamento de genes de resistência obtidos pela genômica da interação cacau-crinipellis, aplicados à programas de melhoramento. Início: Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC. Orientador Fabienne Micheli Maiza Alves Lopes. Estudo funcional de fatores de transcrição WRKY da interação cacau-Crinipellis perniciosa. Início: Tese (Doutorado em Genetica e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador Fabienne Micheli Sarah Alves de Melo. Análise bioquímica e funcional do gene relacionada à patogênese (PR10) isolado de uma biblioteca de cDNA da interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa . Início: Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador - Abelmon Gesteira

23 Agradecimentos Fapesb UESC CIRAD Dr. Júlio Cascardo
Dr. Nicolas Carles e Dra. Fabienne Micheli pela a análise de bioinformática Dra. Karina Gramacho Aos Bolsistas Aline Clara, Lorena Blosi e Antônio Carlos Rodrigues