Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

Apresentação em tema: "Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica"— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica
Prof.Doutor José Cabeda

2 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

3 Espectrofotometria max L=1 cm A(suporte) A(solvente)
Lei de Bert-Lambert C=eA

4 Espectrofotometria max L=1 cm A(suporte) A(solvente)
Lei de Bert-Lambert C=eA max L=1 cm A(suporte) A(solvente)

5 Espectofotometria

6 Espectrofotometria max L=1 cm A(suporte) A(solvente) A(contaminantes)
Lei de Bert-Lambert C=eA max L=1 cm A(suporte) A(solvente) A(contaminantes)

7 Quantificação de DNA max=260 nm max(proteínas) =280 nm ref =320 nm
Concentração = f(OD260). Se L=1cm: dsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência) .

8 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

9 Fazer um gel de agarose

10 Electroforese

11

12 ELECTROFORESE V=IR P=I2R
A resistência é inversamente proporcional á secção e á força iónica da solução

13 TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE) Acrilamida Horizontais Verticais
Seakam Nusieve Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturante Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida /TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturante Horizontais Verticais

14 Electroforese em campo pulsado (PFGE)

15 Electroforese Capilar
Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno) Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiência Separações muito boas, num período de tempo inferior.

16 Electroforese Capilar (II)
Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.

17 Electroforese capilar (III)

18 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

19 REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Brometo de etidio e análogos Radioactividade 32P e 33P 35S 125I 14C 3H Tempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geis Nitrato de prata

20 Marcação de sondas Radio-isótopos 32P 33P 35S 3H 14C 125I

21 Marcação de sondas Digoxigenina Biotina
detecção directa da cadeia dupla

22 Enzimas para a marcação de sondas
Polimerases Actividade exonucleolitica Temp. optima estabilidade térmica TdT

23 Tipos de sondas Oligonucleótidos inserts de plasmideos prod. de PCR

24 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

25 Fotografia

26 FOTOGRAFIA Abertura do diafragma Tempo de exposição
Focagem e profundidade de foco Filtros necessários Tipos de fotos Polaroid Sistemas alternativos

27 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

28

29 Aquisição computorizada de imagens de geis

30 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

31

32 Integração de histogramas

33 Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

34 Reacção de restrição

35 SISTEMAS R-M Protecção contra DNA estranho
TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas) reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequencias As endonucleases requerem Mg2+ e as metiltransferases requerem s-adenosylmetionina endonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomero

36 SISTEMAS R-M TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de reconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência reconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia) TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantes

37 MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO
Instabilidade térmica Concentração de glicerol Tampão de reacção Actividade enzimática: 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µl Homogeneizar por pipetagem Verificar a temperatur de reacção

38 Genética Molecular em Medicina Transfusional
Técnicas de estudo de mutações desconhecidas Prof.Doutor José Cabeda

39 Técnicas de estudo de mutações desconhecidas
Métodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clamps DGGE Perpendicular Paralelo CDGE TTGE Métodos Baseados na conformação SSCP HA CSGE

40 “Melting Profiles” Vários domínios de fusão
As moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total

41 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Gradiente de desnaturação Químico Temperatura O gradiente pode ser: Perpendicular ao campo eléctrico Paralelo ao campo eléctrico

42 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes homoduplexes

43 Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

44 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão

45 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
Vantagens Mais fácil de fazer os geis Mais reprodutível de gel para gel Desvantagens Mais difícil de acertar a gama de Tm

46 Métodos baseados na conformação
Conformação do dsDNA não depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)

47 Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP)
dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido Renaturação rápida Corrida em condições semi-desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 mutantes WT2

48 Heteroduplex Analysis (HA)
Heterodupletos causam Distorção na conformação Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M

49 Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

50 Conformation Sensitive Gel Electrophoresis
Principio: Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com bp

51 Hibridização desnaturar

52 Hibridização Adicionar sonda

53 Hibridização

54 Hibridização Adicionar substracto

55 Dot-Blot

56 Variações Hibridização em microplaca hibridização reversa

57 DEIA (hibridização reversa em microplaca) (detecção com anti-dsDNA)

58 Inno-Lippa Hibridização em filtro
Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Hibridização reversa Marcação no produto do PCR

59

60 Resultados do INNO-LIPA

61 MEIA

62                                                                                                          

63 Southern Blot

64

65 Northern Blot Semelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNA
Não utiliza reacções de restrição