Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

Apresentação em tema: "Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica"— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica
Preparação de Ácidos Nucleicos Prof.Doutor José Cabeda

2 Preparação das células: pulverização pós congelação

3 Preparação das células: homogeneização

4 MagnaLyser

5 Magna Lyser WorkFlow

6 FastPrep

7 Sonicação Principio de funcionamento semelhante ao MagnaLyser
Fonte de agitação são ultrasons

8 Preparação das células do sangue: Centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll)

9 Preparação das células do sangue: Lise dos eritrócitos

10 PREPARAÇÃO DE DNA E RNA DNA e RNA :
Lise suave e solubilização do DNA/RNA Destruição enzimática das proteínas (proteases) Destrição e precipitação química das proteínas (fenol/clorofómio/álcool isoamilico) Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio) Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia remoção de sais)

11 Método do fenol/ clorofórmio

12 Método do salting-out

13 Libertação dos ácidos Nucleicos
Para alguns procedimentos os ácidos nucleicos podem não ser puros Remover a hemoglobina com choque osmótico Utilizar o pellet celular Libertar ácidos nucleicos com choque térmico (ex PCR)

14 Adsorpção A Silica Em 1979 Vogelstein & Gillespie descobrem que o DNA adsorve a pó de vidro (silica) na presença de NaI Posteriormente verificou-se que outros agentes caotrópicos como guadinida isotiocianato tem a mesma propriedade que o NaI Diferentes espécies de Ácidos nucleicos adsorvem diferentemente em função da força iónica e pH

15 Separação de ácidos nucleicos por cromatografia de troca iónica

16 Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do pH

17 Colunas de sílica (ex. Qiagen)

18 Formato de 96 poços

19 Vacuo Versus Centrifugação

20 Qiagen Biorobot 9604

21 Método de Boom Sample + Lysis buffer GuSCN Nucleic acid Wash
Silica Wash Proteins and Lipids Elution buffer processing time 10 samples/1.5h Centrifugation Purified Nucleic acid

22 “Boom” compatible Sample Types
Full Blood Serum/plasma PBMC/PBL Sputum Urine Brain tissue Spleen tissue Liver tissue Faeces Throat swabs Dermal lesions swabs Cerebro spinal fluids Cervical smears Pus samples Foodmatrices Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), , 1990

23 Nuclisens Extractor

24 Unidade Principal

25 Baía dos reagentes

26 Cartridge modules

27 As cartridges

28 MagnaPure (Roche)

29 EZ1

30 EZ1

31 Magna Compact

32 Outros sistemas automáticos