Testes de Reagentes Marcados

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1 Testes de Reagentes Marcados
Testes utilizados em Imunologia Clínica – Testes de Reagentes Marcados Profa Alessandra Xavier Pardini Imunologia Clínica

2 Alta sensibilidade Boa especificidade Direta – detecção de Ag Indireta – detecção de Ac Competição – amostra compete com reagente marcado Custo mais alto – produção dos reagentes Permitem automação completa ou não Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag Reagente marcado – Ag ou Ac Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado

3 Reagente marcado - Marcação não modifica interação Ag-Ac - Alto custo - Permite detecção de classes específicas de Ac para um determinado Ag - Tipo de marcador determina nome do teste MARCADOR Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA Enzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT

4 Radioimunoensaio - Primeira técnica com reagente marcado desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes tratados com o hormônio - radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosina em proteínas - vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramas - desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional – radiosótopos - Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios

5 Princípio quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não marcado presente na amostra através de ligação específica medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida - radiações  e  - contador de cintilação - radiação  - contador gama de cristal sólido Realizado em 3 estágios Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão Estágio 2 – interpolação dos resultados Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida)

6 interferente: fração não ligada
Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema com fase sólida - Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície contínua (tubos, discos e placas)‏ Ac + traçador + Ag da amostra carbono PEG

7 Tipos de Radioimunoensaio

8 Contador de radiação gama
cintiladores

9 IMUNOFLUORESCÊNCIA

10 Princípio: Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.

11 Fluorocromos - São substâncias que, absorvem luz de um comprimento de onda menor quando excitados com luz UV, emitem luz em comprimento de onda maior (fluorescência). - Características: estabilidade, grande capacidade de absorção, absorção e fluorescência de luz no espectro visível, nenhuma interferência com a reação imunológica.

12 Excitação (nm) Emissão (nm)‏
Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag Excitação (nm) Emissão (nm)‏ Fluoresceína FTIC Texas Red R-ficoeritrina - desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada, dificuldade de automação - vantagens: específica e reprodutível - tipos – direta, indireta e citometria de fluxo

13 Cuidados: - padronização adequada do conjugado fluorescente (titulação)‏ - treinamento do pessoal que realizará a leitura, sendo subjetiva, deve ser padronizada para evitar erros que super ou subestimem a fluorescência

14 Reagentes necessários
Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais Ag ou amostras fixas em lâmina de vidro Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas – melhoram a intensidade da emissão de fluorescência Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a visualização da fluorescência Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima

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16 São fatores que interferem na imunofluorescência: - a qualidade do vidro/lâmina/lamínula - qualidade e tratamento dos Ag fixados antigenicidade e acessibilidade - temperaturas e tempo de incubação - lavagens adequadas - montagem da preparação em glicerina alcalina - microscópio perfeitamente calibrado e limpo - corantes: diminuem a coloração de fundo, facilitando a leitura da fluorescência (azul de Evans)‏

17 Microscópio - fonte de luz de alta intensidade lâmpada de mercúrio ou halogênio filtros de excitação (ativam a fluorescência)‏ filtros de barreira (remover interferentes)‏ microscópios de transiluminação microscópios de epiiluiminação (apresentam a vantagem de combinar a luz transmitida para exame de contraste de fase, análise da amostra em diferentes comprimentos de onda, no caso de utilização de mais de um fluorocromo) (a luz UV não tem chance de atravessar a ocular)‏

18 Microscópio de imunofluorescência com epiluminação
Filtro de excitação lâmina Fluorescência emitida Filtro de emissão Fonte de luz branca câmera Fibra óptica Fibra óptica

19 Microscópio de imunofluorescência automatizado

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22 Reação de Imunofluorescência Reação de Imunofluorescência direta Reação de Imunofluorescência indireta Reação de Imunofluorescência de captura Reação de Imunofluorescência amplificada com complemento Reação de Imunofluorescência amplificada com sistema avidina- biotina

23 Conjugado fluorescente
Imunofluorescência direta Conjugado - Ac marcado com fluorocromo Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes Desvantagens: um conjugado para cada Ag Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele célula Conjugado fluorescente

24 Adenocarcinoma de glândula salivar humana
diiodeto de propídio ITCF

25 Linfócitos infectados com HIV
ITCF

26 Imunofluorescência indireta - Conjugado Ac antiimunoglobulina específico – classes - Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescência - Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes doenças - Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de automação

27 Conjugado fluoresncente
Uso: detecção de Ac para Treponema pallidum (FTA-ABS), Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, auto-anticorpos. Conjugado fluoresncente Anticorpo primário Citosol

28 Microscópio de fluorescência
Anticorpo Antígeno Reação primária Reação secundária Conjugado Anticorpo FITC lavagem Microscópio de fluorescência

29 Fluorescência indireta para Sífilis

30 Fluorescência indireta para Chagas

31 Fluorescência indireta para HIV

32 Autoimune

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35 anti-Células Epiteliais

36 CMV

37 Citometria de fluxo Princípio: análise individual e simultânea de componentes celulares através da medição do desvio de luz incidente sobre uma célula e de sinais fluorescentes emitidos pela mesma Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares de células por segundo Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamento Vários fluorocromos Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias

38 Conjugado fluorescente
Suspensão de mistura de células Conjugado fluorescente Feixe de laser Detector Defletor Células não- fluorescentes Células fluorescentes

39 Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos:
- baixo ângulo de dispersão – tamanho das células - ângulo de dispersão de 90o – granulação das células Fluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada por fotodetectores e convertida em sinais processados, quantificados e analisados por um computador Sinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas por um sistema de canais, originado histogramas

40 Técnicas imunoenzimáticas
- Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado ENZIMA - elevada especificidade - fácil de ser obtida na forma purificada - conjugação a Ag e Ac – sem interferências - produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com pequenas quantidades de enzima - estável - custo acessível - vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase - determina o tipo de substrato

41 Produto colorido solúvel ou insolúvel
SUBSTRATO CROMOGÊNICO - ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos solúveis ou insolúveis - quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou comparação com padrão - depende do tipo da enzima utilizada Substrato Produto colorido solúvel ou insolúvel

42 - substrato H2O2 ligado a um cromógeno
PEROXIDASE - substrato H2O2 ligado a um cromógeno - cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB - cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol FOSFATASE ALCALINA - cromógeno com produto solúvel - NPP - cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT 450 amarelo lilás P-NFF 5-B-4-C-3-IF Fosfatase alcalina 492 laranja, azul marrom, violeta OPD, TMB DAB, 4CN H2O2 Peroxidase nm cor cromógeno substrato enzima

43 SUBSTRATO FLUORIGÊNICOS
- emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima - quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro FOSFATASE ALCALINA - 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4- metilumbeliferona)‏  excitação Emissão Fluorescência

44 SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE
- amplificação de sinal  hormônios e marcadores tumorais - emitem brilho após serem consumidos pela enzima - quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro FOSFATASE ALCALINA - adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion (adamantildioexietano) brilho luminol

45 Ensaio heterogêneo - etapa de lavagem – retira reagente marcado não ligado a fase sólida FASE SÓLIDA - conhecido como suporte - tubos, microplacas, micropartículas ou tiras - partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno - micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorção em fibra de vidro ou captura - tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT

46 Immuno-Dot Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISA fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel – mancha (dot) pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-radiografia Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com sensibilidade e especificidade boas Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos epidemiológicos

47 Fracione o pente de acordo com o número de amostras
Colocar as amostras e os controles nos pocinhos da fileira A Colocar o pente na fileira A e incubar segundo as instruções Colocar o pente na fileira B e incubar Incubar nas fileiras C, D e E. Reação com substrato na fileira F Ler os resultados e comparar com o padrão

48 ELISA - capaz de detectar < [ ] Ag e Ac reagente ligado a uma enzima imobilização em fase sólida  placa de ploiestireno Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, baixo custo e adaptação a diferentes graus de automação tipos: direta, indireta, de captura e de competição Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas

49 Determinação de Ag ELISA direto de captura ELISA direto de competição Determinação de Ac ELISA indireto ELISA indireto de captura ELISA indireto de competição

50 ELISA direto de captura
Ag na amostra Incubação Ac fixado na placa Conjugado Ac marcado Lavagem Adição do substrato, revelação e leitura conhecido como sanduíche Após a adição de um reagente, realiza-se etapa de lavagem para retira reagente não ligado Vantagens: Desvantagens: Uso:

51 ELISA direto de competição
Vantagens Desvantagens Uso

52 ELISA indireto Vantagens: único conjugado para vários sistemas
Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa

53 Resultado visual (qualitativo)‏ densidade óptica (DO) (quantificação / espectrofotômetro) Limiar de reatividade (“cut-off”)‏ Titulação (diluição em série)‏ Absorbância Unidade padrão (absorbância transformada em unidade)‏

54 ELISA indireto de captura
Vantagens: único conjugado para vários sistemas Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa

55 ELISA indireto de competição
Vantagens: único conjugado para vários sistemas Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa

56 Lavadora de microplacas
Leitora de microplacas acoplada a computador

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59 Western Blotting identificação de proteínas reconhecidas por Ac separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de poliacrilamida transferência eletroforética - nitrocelulose incubação com amostras - presença de Ac específicos - complexo formado – conjugado Visualização = cromógeno - precipitado colorido - teste confirmatório

60  preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente)‏
Etapas  preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente)‏  SDS (detergente aniônico/confere carga negativa)‏  migração: pólo -  pólo +  preparo da amostra (solubilização das proteínas)‏  tampão corrida  voltagem/amperagem  transferência (semi-seco; “over-night”)‏  membrana (nitrocelulose; PVDF)‏

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62 Emprego: pesquisa de Ag ou Ac  diagnóstico
qual proteína está sendo reconhecida  diferentes perfis  fase da doença

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