Carregar apresentação
A apresentação está carregando. Por favor, espere
2
Cromossomo X Mamíferos: fêmeas XX e machos XY
inativação de um dos cromossomos X durante o desenvolvimento inicial. compensação de dose nas fêmeas
3
Inativação do X Três “ondas” de inativação: Trofoectoderme
Endoderme primitiva do blastocisto Inativação sujeita ao impriting, exclusiva do X paterno (Xp) Células do epiblasto originadas da massa de células interna (ICM) Inativação aleatória (Xp ou Xm) Tecidos extraembrionários
4
Xist Responsável pela inativação do X. RNA não traduzido.
Cobre o cromossomo X in cis. Causa o silenciamento de genes do cromossomo X que cobriu. Cromossomo X ativo: Xist inativo. Cromossomo X inativo: Xist ativo.
5
Xist Em células do tecido embrionário:
“encapamento” do cromossomo X pelo Xist é rapidamente seguido de silenciamento gênico. Durante o desenvolvimento inicial: Expressão do Xist a partir do estágio de duas a quatro células. Expressão apenas de origem paterna. Expressão do Xist materno: apenas no estágio de mórula.
6
Primeiros sinais citológicos detectáveis da inativação do X: apenas no estágio de cinquenta células.
Logo após a fertilização: Xm e Xp ativos. Estudos com RT-PCR: alguns genes paternos já possuem transcrição diminuída na embriogênese inicial. Predisposição do X paterno à inativação: devido à sua passagem pela linhagem geminativa masculina (vesícula sexual).
7
Muitas questões não resolvidas a respeito da iniciação e cinética da inativação do X
8
Xist e mudanças iniciais na cromatina do Xp
9
Metodologia Exame do Xp “encapado” com Xist durante a embriogênese pré-implantação. Embriões nos estágios de duas células até blastocisto. Análise direta, sem cultura in vitro. Hibridização in situ com RNA fluorescente (FISH). Imunofluorescência.
10
Detecção de Xist Acúmulo de Xist em todos os blastômeros interfásicos a partir do estágio de quatro células. Estágio de duas células: pequeno sinal de Xist.
11
Estado inicial da cromatina no Xp
Fisch Imunofluorescência H3K9 e H3K27 e interações com Eed e Enx1 características de cromossomos X em inativação * H3K9 está associada com o Xp durante a espermatogênese
12
Estado inicial da cromatina no Xp
Estágio de quatro a oito células: Não há acumulação de H3 metilada em K9 ou K27.
13
Não há acumulação de Eed e Enx1.
14
Estágio de 16 células: Detecção destes marcadores em alguns blastômeros.
15
Estado inicial da cromatina no Xp
Acumulação dos marcadores no Xp tem intervalo similar Enx => metiltransferase de histonas que metila a K27 H2A => acumula no mesmo intervalo de tempo que esses marcadores. Mudanças principais na cromatina do Xp começam neste estágio (16 células)
16
Estado inicial da cromatina no Xp
Proporção de blastômeros que contêm os marcadores varia nos estágios de 16 a 32 células. Blastocisto: 90% dos blastômeros possuem os marcadores. * Metilação na H3K9 começa mais tarde (32 células) => marcador independente
18
Estado inicial da cromatina no Xp
Outras análises: hipoacetilação da H3K9 hipometilação da H3K4 eventos iniciais na inativação do X em células de tecidos embrionários
19
4 células: nenhum sinal destas modificações
8 células: detectados em alguns blastômeros
20
32 células: mais de 90% dos blastômeros
ocorrem após o “empacotamento” pelo Xist mas antes dos outros marcadores
21
Xist e atividade transcricional do Xp
22
Metodologia Análise do silenciamento do Xp em nível transcricional em células únicas. Anticorpo (H5): reconhece a forma elongadora da RNA PolII (presente em cromatina transcricionalmente ativa). Em células ES em diferenciação: exclusão da RNA PolII do cromossomo X logo após o empacotamento pelo Xist.
23
Atividade transcricional do Xp
Em embriões na pré-implantação: 2 células: não há exclusão da RNA polII.
24
4 células: primeiros sinais de exclusão.
32 células: quase 100% de exclusão.
25
Atividade transcricional do Xp
Confirmação do silenciamento transcricional de Xp: RNA FISH para detectar transcritos do gene Chic1/Brx do cromossomo X.
26
2 células: dois sinais de transcrição, um adjacente ao Xist em alguns embriões.
8 células: um sinal dentro do domínio do Xist em alguns blastômeros. 16 células: sinal não é mais visto em mais de um blastômero.
27
Atividade transcricional do Xp
Início da inativação da transcrição do Xp: Estágio de quatro a oito células Inativação do Xp: No estágio de 32 células atinge a grande maioria dos blastômeros Inativação do X começa bem antes da diferenciação celular
28
Blastômeros contêm o Xp inativo
Exclusão de Pol II Modificação de histonas Associação de Eed/ Enx1 ICM inner cell mass
29
Blastômeros contêm o Xp inativo
Presença de RNA Xist Presença de Eed e Enx1
30
Inativação de Xp no ICM Imunocirurgia: retirada do trofoectoderma
Blastocistos no início: Presença de RNA Xist Exclusão de RNA Pol II Hipoacetilação na H3K9 Hipometilação na H3K4 Metilação na H3K9 e K27 Acumulação de Eed e Enx1
31
Inativação de Xp no ICM Blastocisto no início
Acumulação de Eed e Enx1
32
Inativação de Xp no ICM Blastocisto no início
Metilação na K27
33
Inativação de Xp no ICM Blastocistos tardios:
RNA xist estava disperso ou ausente Ausência de acumulação de Eed e Enx1 Metilação na H3K27 Blastocistos no início cultivados por 24hs Presença de RNA xist e as características da mórula e trofoectoderma Blastocistos tardios cultivados por 24hs Perda de RNA xist, Eed e Enx Essa metilação depois também vai ser perdida. Acreditava que seria endoderma primitivo
34
Inativação de Xp no ICM Blastocisto tardio
Ausência de acumulação de Eed e Enx1
35
Inativação de Xp no ICM Blastocisto tardio
Metilação na H3K27
36
Inativação de Xp no ICM Blastocisto em cultura
Presença de RNA Xist
37
Inativação de Xp no ICM
38
Conclusão
39
Conclusão
40
Conclusão Ciclo dinâmico da inativação de Xp
Xp inativado – reativação – inativação randômica Esse estudo propõe que RNA Xist é o único imprint necessário para levar modificações na cromatina que levam a inativação preferencial do Xp. Pressão evolucionária reprime xp no início do desenvolvimento e ativação e inativação randômica permitem reprogramação do ICM
Apresentações semelhantes
