Métodos Fenotípicos para Detecção dos Mecanismos de Resistência Antimicrobiana em Bacilos Gram-Negativos Prof. Dr. Rodrigo Elisandro Mendes Pós-doutorando.

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1 Métodos Fenotípicos para Detecção dos Mecanismos de Resistência Antimicrobiana em Bacilos Gram-Negativos Prof. Dr. Rodrigo Elisandro Mendes Pós-doutorando da Disciplina de Infectologia Universidade Federal de São Paulo - EPM

2 sair Índice Principais Problemas Parede celular bacteriana
Resistência Bacteriana a Antimicrobianos Principais Problemas em Enterobactérias Principais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores -lactamases Localização dos genes bla Detecção de -lactamases -lactamases de espectro ampliado ESBL no Brasil Infecções por amostras produtoras de ESBL SURTO Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL Detecção de amostras produtoras de ESBL Testes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL -lactamases do Grupo 1 (AmpC) Resistência aos carbapenens Enterobactérias Detecção de Metalo- -lactamases Detecção de amostras produtoras de MBL Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Metalo--lactamases emEnterobactérias no Brasil Índice sair

3 índice sair Principais Problemas Enterobactérias
Resistência às cefalosporinas de amplo espectro Resistência aos carbapenens (rara) Bacilos Gram-negativos não fermentadores Resistência aos carbapenens Resistência às polimixinas (rara)

4 Bactéria Gram-positiva Bactéria Gram-negativa
Parede celular bacteriana sair índice Pelcza, Microbiology, Bactéria Gram-positiva Bactéria Gram-negativa

5 Bactéria Gram-positiva

6 Bactéria Gram-negativa

7 Resistência Bacteriana a Antimicrobianos
sair índice

8

9 Principais Problemas em Enterobactérias
sair índice Resistência às cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos  Produção de -lactamases de espectro ampliado (ESBL) Produção de -lactamases AmpC Resistência aos carbapenens (rara) Falsa resistência Produção de ESBL/AmpC + alt. da membrana externa Produção de Metalo- -lactamases (MBL)

10 Principais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores
sair índice Resistência aos carbapenens  Produção de AmpC + alt. da membrana externa Produção de Metalo- -lactamases (MBL) Efluxo ativo Resistência às polimixinas (rara) Alteração da composição lípidica do LPS e/ou Hiperexpressão da porina OmprH

11 -lactamases índice sair
São enzimas que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico Principal mecanismo de resistência entre gram-negativos Grande diversidade Produção mediada pelo DNA cromossômico ou extra-cromossômico (plasmídios e transposons)

12 Localização dos genes bla
sair índice Transmissão e disseminação Divisão binária Cél. Mãe para cél. filha DNA Cromossomal Conjugação entre bactérias de espécies diferentes DNA Extra-Cromossomal Conjugação entre bactérias da mesma espécie

13 Detecção de -lactamases
sair índice + - Disco de Nitrocefin

14 + -

15 -lactamases de espectro ampliado (extended-spectrum beta-lactamase)
sair índice Bush et al., AAC 39:1211, 1995 -lactamases de espectro ampliado (extended-spectrum beta-lactamase) Enterobactérias: E. coli e K. pneumoniae Mediadas por genes plasmidiais não induzíveis Vários genes: tem, shv, per, ges, ctx, oxa Degradam todos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens e das cefamicinas Geralmente, inibidas pelos inibidores de -lactamases (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam)

16 -lactamases de espectro ampliado Importância Clínica
sair índice Posso utilizar cefalosporinas de amplo espectro para o tratamento de Infecções causadas por bactérias produtoras de ESBL? ?

17 -lactamases de espectro ampliado Importância Clínica
sair índice Paterson et al., J Clin Microbiol 39:2206, 2001. MIC ( µg /ml) Fal ência terapêutica Morte até 14 dias após bacteremia % (N) N(%) 8 100 (6/6) 33 (2/6) 4 67 (2/3) 0 (0/3) 2 33 (1/3) 0 (0/3) 1 27 (3/11) 18 (2/11) Total 54 (15/28)

18 ESBL no Brasil índice sair
CTX-M-8 - Rio de Janeiro - C. amalonaticus e E. cloacae Bonnet et al., J Clin Microbiol 44:1936, 2000. BES-1 - Rio de Janeiro - Serratia marcescens Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother 44:3061, 2000. CTX-9 e Rio de Janeiro - E. coli e E. cloacae Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother. 45:2269, 2001. SHV-27 - Aracajú - Klebsiella pneumoniae Corkill et al., J Antimicrob Chemother 47:463, 2001. CTX-M - São Paulo - Klebsiella pneumoniae Carmo Filho. Doutorado UNIFESP/EPM, 2003.

19 Infecções por amostras produtoras de ESBL SURTO
sair índice Amostras de P. mirabilis produtoras de ESBL isoladas pelo Programa SENTRY 1997 - 1998 l 1 2 l l 6 7 No. Ribogrupo PFGE pI 1 1019-4 W2 5.4, 7.6, 7.9 2 W3 3 637-8 Z1 4 Z3 5 Z2 6 C 7

20 Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL
sair índice Todos os métodos fenotípicos se baseiam na inibição da atividade da enzima pelos inibidores de -lactamases (IBL)

21 Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL
sair índice Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS) Teste de Adição de IBL aos discos de cefalosp. Discos combinados Teste de dupla-difusão em disco Etest Métodos automatizados

22 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Limites de Triagem do CLSI E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis* sair índice Disco Difusão MIC Aztreonam < 27 mm > 2 g/mL Ceftazidima* < 22 mm > 2 g/mL Ceftriaxona < 25 mm > 2 g/mL Cefotaxima* < 27 mm > 2 g/mL Cefpodoxima* < 17 mm > 2 * / > 8 g/mL CLSI, 2005

23 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis sair índice Disco difusão Meio de Müller-Hinton Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os associados ao ácido clavulânico  POSITIVO Aumento do halo  5 mm da associação CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX

24 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI Teste de adição de IBL sair índice Disco difusão Ácido Clavulânico Preparar solução estoque 1000 l fresca ou congelada a –70°C Adicionar 10 l desta solução sobre os discos de CAZ e CTX uma hora antes do teste Controle de Qualidade - Positivo: K. pneumoniae ATCC - Negativo: E. coli ATCC 25922

25 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste de adição de IBL sair índice Jacoby & Han, 1996 Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000.

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27 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis sair índice CLSI, 2005 Métodos dilucionais Meio de Müller-Hinton com a concentração de cátions ajustada Concentrações dos antimicrobianos: ceftazidima: g/ml ceftazidima/ácido clav.: 0.25/4-128/4g/ml E cefotaxima: g/ml cefotaxima/ácido clav.: 0.25/4-128/4g/ml  POSITIVO Redução  3.0 diluições

28 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI Teste de adição de IBL sair índice CLSI, 2005 Métodos dilucionais Controle de Qualidade Positivo: K. pneumoniae ATCC Negativo: E. coli ATCC 25922

29 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste de adição de IBL sair índice Vantagens Teste simples; Fácil interpretação; Custo Limitações Preparo e armazenamento da solução estoque de ácido clavulânico; Caracterização errônea

30 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados sair índice 2 3 1 4 1.Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico, 3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico, 5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico 6 5

31 2 3 1 4 6 5 1. Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,
3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico, 5. Cefotaxima Cefotaxima + Ác. Clavulânico

32 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados sair índice Vantagens Teste simples; Fácil interpretação; Custo Limitações Substrato (novo disco com cefpiroma); Não detecção de amostras produtoras de SHV-6

33 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados sair índice M'Zali et al. J Antimicrob Chemother45:881-5 , 2000. Carter et al. J Clin Microbiol 38: , 2000. Sensibilidade Ceftazidima = 86% Cefotaxima = 65.5% Combinados = 93% 100% das amostras produtoras de ESBL apresentaram aumento no halo > 5 mm, enquanto as produtoras de AmpC e K1 apresentaram aumento < 1 mm.

34 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados sair índice De Gheldre et al. J Antimicrob Chemother. 52:591-7, 2003 Sensibilidade/Especificidade (%) Escherichia coli e Klebsiella spp. CAZ/clav: 88% e 92% CTX/clav: 90% e 92% CPR/clav: 95% e 84% CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 82% Enterobacter aerogenes CAZ/clav: 94% e 100% CTX/clav: 94% e 100% CPR/clav: 94% e 100% CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 100%

35 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados sair índice Pereira et al. J Bras Patol Med Lab 39: , 2003. 134 amostras de K. pneumoniae do Hospital Säo Paulo – 1996/2001 Discos da Oxoid Cefotaxima e cefpodoxima: S e E = 100% Etest ESBL S = 96% e E = 100%

36 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL Distância de 30 mm
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação sair índice Jarlier, 1988 CPM AMX/AC CRO/ CTX CAZ Distância de 30 mm ATM

37 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação sair índice Jarlier, 1988 Teste Positivo

38 Teste Positivo

39 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação sair índice Vantagens Teste simples; Não necessita de reagentes especiais Limitações Distância entre os discos; Armazenamento dos discos com ácido clavulânico; Interpretação

40 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest® sair índice Cormican & Jones, 1996 Fitas disponíveis Ceftazidima, cefotaxima e cefepima Critério de positividade Redução  3.0 diluições Razão TZ/TZL > 8 Razão CT/CTL > 8 TZ = 32 TZL =2 32  16  8  4  2

41 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest® sair índice Cormican & Jones, 1996

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43 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest® sair índice Cormican & Jones, 1996 Zona Fantasma

44 Zona Fantasma

45 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest® sair índice Vantagens Teste simples; Limitações Substrato específico; Não detecção de amostras, cuja as MICs situem acima das diluições testadas; Custo

46 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Métodos Automatizados sair índice MicroScan – Painéis de Gram-negativos Triagem para ESßL Poços que contêm cefpodoxima 4 g/mL e ceftazidima 1 g/mL associados ao clavulanato ESßL plus Confirmation Panel Antimicrobiano (conecntação testada em g/ml) Aztreonam 0.5 – 64 Cefpodoxima 0.5 – 64 Cefepima 1 – 32 Ceftazidima 0.5 – 128 Cefoxitina 2 – 32 Ceftazidima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Cefotaxima 0.5 – 128 Ceftriaxona 1 – 64 Cefotaxima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Meropenem 0.5 – 16 Cefotetan 1 – 32 Piperacillina 16 – 64 Imipenem 0.5 – 16

47 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Métodos Automatizados sair índice Vitek – Painéis de Gram-negativos Triagem para ESßL Poços que contêm cefotaxima e ceftazidima 0,5 g/mL associados ao clavulanato

48 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
Métodos Automatizados sair índice Vantagens Padronização intra- e inter-laboratorial; Limitações Substrato específico; Não detecção de amostras, cuja as MICs situem acima das diluições testadas; Custo

49 índice sair Detecção de amostras produtoras de ESBL
K. pneumoniae ATCC – CQ ESBL + sair índice CLSI, 2005

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51 Avaliação da Sensibilidade e Especificidade de Diferentes Testes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL sair índice Reis et al., J Bras Patol Clin 37:43, 2001. Teste Sens. Espec. Disco difusão (bkpts ESBL - NCCLS) 89 62 Dupla Difusão 41 100 ESBL Etest® 89 98 Disco difusão (CTX + AZT - NCCLS) 88 83 Adição de clavulanato 97 47 MICs para 5 substratos (Etest) 100 100

52 Detecção de amostras produtoras de ESBL
sair índice Sugestão Limites de triagem estabelecidos pelo CLSI; + Teste de dupla-difusão em disco, ou Discos combinados

53 -lactamases do Grupo 1 (AmpC)
sair índice Livermore. Scand J Inf Dis 79(Suppl):7-16, 1991 Antimicrobianos hidrolisados: aztreonam, cefalosporinas de amplo espectro e penicilinas de amplo espectro Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa - cromossomal Não são inibidas por inibidores de β-lactamases Produzidas em pequena quantidade a menos que sejam induzidas Agente retirado  produção volta a níveis basais ou pode ocorrer mutação e desrepressão

54 índice sair -lactamases do Grupo 1 (AmpC)
Teste de indução de -lactamases AmpC sair índice CRO D CFO CAZ Distância em mm = raio do beta-lactâmico - 3 2

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56 Resistência aos carbapenens
Enterobactérias sair índice Checar resultados das cepas ATCCs Verificar a validade e a estocagem dos discos; Verificar a identificação; Repetir o teste de sensibilidade  técnica  Confirmada  Lab. de referência

57 Resistência aos carbapenens
Metalo--lactamases sair índice (Page 2002, Rossolini et al 2001; Nordmann & Poirel 2002, Toleman et al 2002) Hidrolisam penicilinas, cefalosporinas e carbapenens Genes cromossômicos e plasmidiais (transposons, integrons) Zn++ como cofatores enzimáticos Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol Família IMP-1 a -16 (Japão, China, Europa, Canadá, Portugal, Taiwan, Brasil) Família VIM-1 a -11 (Argentina, Colômbia, Europa, Coréia, Taiwan, EUA) GIM-1 (Alemanha) SPM-1 (São Paulo Metalo- -lactamase)

58 Detecção de Metalo- -lactamases Importância Clínica
sair índice A maior parte da produção destas enzimas é mediada por genes plasmidiais, que podem se disseminar entre espécies distintas  Medidas de Controle Detecção do mecanismos – opções terapêuticas – Novas drogas como IMBL.

59 índice sair Detecção de amostras produtoras de MBL
Disco- aproximação IMBL sair índice Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000. IMBL CAZ IMP Distância de 4-5 cm Distância de mm IMBL EDTA – 5 l 100 mM 2-MPCA puro – 2 a 3 l

60 índice sair Detecção de amostras produtoras de Metalo--lactamases
Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000. Disco- aproximação com ácido 2-mercaptopropiônico NEGATIVA POSITIVA

61 Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Adição de EDTA
sair índice Critério de positividade: 5 mm? IMP/EDTA IMP

62 índice sair Detecção de amostras produtoras de
Metalo- -lactamases - Etest sair índice Walsh et al., J Clin Microbiol 40:2755-9, 2002. Critério de positividade : Redução  3.0 diluições

63 Detecção de amostras produtoras de
Metalo- -lactamases sair índice Controles de Qualidade CQ -: P. aeruginosa ATCC 27853 CQ +: P. aeruginosa A (produtora de SPM) P. putida 48 – 1234 (produtora de IMP -1)

64 Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo--Lactamase in Distinct Brazilian Regions sair índice Gales et al. J Antimicrob Chemother 52:699, 2003.

65 Metalo--lactamases em Enterobactérias no Brasil
sair índice First Isolation of a Metallo--lactamase-Producing-multiresistant Klebsiella pneumoniae from a Patient in Brazil Lincopan et al. J Clin Microbiol 43:516, 2005. Outbreak caused by a Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae Producer of IMP-1 Metallo--Lactamase in a Brazilian Teaching Hospital Grimbaun et al. 44th ICAAC, Washington, DC