Métodos para a quantificação de proteínas

Apresentação em tema: "Métodos para a quantificação de proteínas"— Transcrição da apresentação:

1 Métodos para a quantificação de proteínas
Biotecnologia Prof. Priscilla Russo

2 Proteínas Como estudar uma proteína? Separá-la e purificá-la.
2. Determinar a sua massa molecular. 3. Determinar a sua composição e seqüência de aminoácidos. 4. Elucidar a sua estrutura tridimensional. 5. Caracterizá-la funcionalmente.

3 Para separar proteínas
Utilizam-se diferenças nas propriedades físico-químicas das proteínas, resultantes das diferentes sequências de aa: Tamanho Solubilidade Carga Afinidade de ligação

4 Técnicas de separação e purificação de proteínas:
Diálise, ultrafiltração, centrifugação, precipitação Cromatografia de exclusão molecular Cromatografia de troca iônica e da fase reversa Cromatografia de afinidade Eletroforese

5 Princípio: diferente dimensão e forma molecular
Diálise A solução contendo a proteína é colocada no interior do saco de diálise, que é imerso em um grande volume de solvente Chega-se ao equilíbrio entre as concentrações dos dois meios, sendo que as proteínas continuam no interior do saco de diálise e as outras moléculas no exterior.

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7 Ultracentrifugação Zonal
A solução contendo as proteínas é colocada no topo de um gradiente de densidade. Durante a centrifugação, cada proteína se move de acordo com seu coeficiente de sedimentação. Após a centrifugação, as zonas individuais são recolhidas com auxílio de uma seringa.

8 Centrifugação Diferencial
A centrifugação separa os componentes celulares por tamanho e densidade Componentes maiores e mais densos sedimentam (pellet) e os componentes menores e menos densos permanecem suspensos (sobrenadante).

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10 Gradiente de Densidade

11 Princípio: diferença de solubilidade (precipitação)
A solubilidade das proteínas varia com: pH Temperatura Força iônica Constante dielétrica do solvente

12 Técnicas baseadas em diferenças de solubilidade
Precipitação isoelétrica (variação de pH) Salting in / salting out (variação da força iônica) Precipitação por solventes orgânicos

13 Salificação (salting in): a solubilidade aumenta até certo ponto, com o aumento da concentração de sal Dessalificação (salting out): os sais com concentração muito elevada retiram a água de hidratação da proteína, então as suas moléculas precipitam

14 Cromatografia É uma série de processos de separação de misturas.
Ocorre pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas.

15 Métodos cromatográficos de separação de proteínas
Diferentes tipos: Exclusão molecular Troca iônica Afinidade Fase reversa

16 Cromatografia de exclusão molecular
Utilizado para a determinação do peso molecular de diferentes proteínas Após o empacotamento da coluna, aplica-se a amostra e é feita a eluição As moléculas maiores, que não são capazes de penetrar nos poros do gel, serão eluídas antes das moléculas menores.

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18 Cromatografia de troca iônica
As colunas são carregadas com grânulos de carga oposta, retendo as proteínas Ex: moléculas de carga negativa ficam retidas, enquanto as de carga positiva passam pela coluna

19 Cromatografia de Troca iônica

20 Cromatografia de afinidade
A fase estacionária consiste geralmente de agarose ligada a brometo de cianogênio, formando uma ligação covalente. A amostra é aplicada e a proteína que possui afinidade pelo ligante se liga a ele enquanto as demais são eluídas da coluna. A proteína de interesse é então liberada da coluna, com o uso de uma substância que tenha mais afinidade pela proteína do que o ligante

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22 Determinação da composição dos aminoácidos de uma proteína
Ex: determinação da composição de aa do fragmento Ala-gly-asp-phe-arg-gly Hidrolise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24h) Reação de revelação dos aa (ex ninidrina) Separação e quantificação dos aa (ex. cromatografia)

23 Separação e quantificação dos aa por cromatografia HPLC
High Pressure Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência) Matriz de separação: utilizando diferentes propriedades físicas de cada um dos aa, ex carga, forma, hidrofobicidade Eluente: variação controlada das condições do meio Detecção: após sua derivação

24 Resultado de uma cromatografia de aa
Integrando os picos, determina-se a quantidade relativa de cada aa, mas não a sequência

25 Uso da cromatografia no diagnóstico clínico
Leucinose Ex.: aumento de leucina, isoleucina e valina Defeito da desidrogenase dos alfa-cetoacidos ramificados