Reagentes não Marcados

Apresentação em tema: "Reagentes não Marcados"— Transcrição da apresentação:

1 Reagentes não Marcados
Testes utilizados em Imunologia Clínica – Reagentes não Marcados Profa Alessandra Xavier Pardini Disciplina Imunologia Clínica

2 Resposta Imunológica Específica
- é mais elaborada reconhecimento - clonagem (multiplicação de células defesa) - ativação celular - processo complexo - células: ly T e B atacam especificamente o antígeno- resposta imunológica de memória

3 Anticorpos Fab Fc símbolo Sítio de ligação do Ag Molécula de Ac
antígeno Determinante antigênico (epítopo)‏ Cadeia leve Cadeia pesada Fab Fc Região de dobradiça

4 Dinâmica de produção de Anticorpos durante a infecção Durante a infecção realiza-se pesquisa de IgM e IgG para diferenciar a fase em que se encontra a doença Tempo (dias)‏ Primeira exposição ao Ag Segunda exposição ao Ag Resposta secundária Resposta primária Título de Ac no soro ( unidades)‏

5 Determinação de limiar de reatividade
A – Limiar de máxima sensibilidade - triagem B – Limiar com máximas sensibilidade e especificidade – estudos epidemiológicos C – Limiar de máxima especificidade – diagnóstico

6 Introdução - Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para a detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias que desempenhem papel de antígenos - drogas, hormônios, ácidos nucléicos - Utilizam reagentes não marcados (precipitação aglutinação, floculação e complemento) ou reagentes marcados (fluorescência, radioimunoensaio, imunoenzimáticos)‏ - Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, aplicação específica - Podem ser manuais ou semi ou totalmente automatizadas

7 - Anticorpos monoclonais e Antígenos recombinantes = maior desenvolvimento (a) Ac monoclonais: produção, homogêneos, caracterizáveis (b) Ag recombinantes: caracterizáveis, produção em larga escala, especificidade Métodos: - aperfeiçoamento, consolidação do que já existe, tecnologias emergentes, melhora da sensibilidade, confiabilidade no resultado, execução mais simples e adaptáveis a automação - métodos multiparamétricos: desafio de detecção de substâncias diferentes simunltâneamente

8 - Os testes sorológicos têm se tornado cada vez mais refinados e de execução simples, porém, para se garantir a qualidade dos resultados é necessário controle rigoroso - Técnicas cuidadosamente padronizadas (estudo de população, limiar de reatividade) = temperatura, pH, tempo de incubação, títulos, conjugados - As metas para o laboratório clínico devem melhorar a disponibilidade, exatidão e precisão dos testes clínicos, garantir a interpretação correta dos resultados

9 Imunodiagnóstico Designa o diagnóstico por técnicas imunológicas que revelam a presença de determinado antígeno (Ag) ou anticorpo (Ac) no organismo Ensaios ou Testes de Precipitação Fixação do Complemento Neutralização ou Imunoensaios Imunofluorescência Radioimunoensaio Imunoenzimáticos Imunofluorimétricos Quimiluminescência

10 Métodos de Imunoensaios
Reagentes não-marcados Precipitação Aglutinação Ensaios Líticos Reagentes marcados Radioativos Enzimáticos Fluorescentes Quimioluminescentes

11 TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS: REAGENTES NÃO MARCADOS

12 Técnicas rápidas Sistema homogêneo Sensibilidade reduzida Boa especificidade Direta – detecção de Ag Indireta – detecção de Ac Baixo custo Dificultam automação Problemas com reprodutibilidade Não permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vez

13 Precipitação - quantificação de complexo Ag-Ac - depende de [ ] relativas de Ag e Ac - excesso - dissolução do precipitado - zona de equilíbrio - precipitação máxima

14 Concentração de Ag Excesso de Ag Excesso de Ac Equivalência Imunoprecipitação

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16 Imunodifusão - difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi sólido - complexo Ag-Ac - simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexo - dupla: ambos movem-se = encontro – complexo pode ser linear ou radial

17 Imunodifusão simples: Ocorre a imobilização de um dos componentes (anticorpo ou antígeno) no meio gel. Após a gelificação, adiciona‐se ou outro componente e aguarda‐se (por cerca de 1 semana) a formação da linha de precipitação na zona de equivalência

18 Imunodifusão Radial Simples (Mancini)
- utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de anticorpos específicos - perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + 3 concentrações conhecidas do Ag - quantificação de [ ] em soro ou líquor - sensibilidade de 1 a 3ug/mL de antígeno uso: Ig séricas, proteína C reativa (PRC) e proteínas do sistema complemento (C3, C4)‏

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20 diâmetro do halo de precipitação formado relaciona-se com a concentração do antígeno
construção de curva padrão permite determinar a conentração do antígeno

21 Imunodifusão dupla (Ouchterlony)‏
- precipitação Ag-Ac - linhas ou arcos - ausência de linhas indica ausência de Ag ou Ac - depende de [ ] e tamanho da molécula, tamanho dos poros do gel, temperatura, [ ] e pureza do ágar - camada de ágar sobre lâmina de vidro - perfuração – aplicação da amostra - desvantagens: lenta e baixa sensibilidade Uso: vários sistemas antigênicos (artrite reumatóide, lupus, esclerose sistêmica, caxumba)

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23 IMUNOELETROFORESE: IMUNODIFUSÃO RADIAL: Após a migração das moléculas por eletroforese, anticorpos específicos para as moléculas estudadas são adicionadas a uma canaleta, de onde irão se difundir e se ligar aos antígenos (no caso, as moléculas a serem estudadas), evidenciando cada uma das moléculas, separadamente.

24 Nefelometria - muito usada em laboratórios de análises clínicas - Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz - Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com sensibilidade adequada e pequenos volumes de amostra, não necessita separação de fases - Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações inespecíficas, múltiplas diluições de antígenos muito concentrados - Sensibilidade - 1ug/mL Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatóide, proteína c-reativa, fatores de coagulação, imunocomplexos e hormônios

25 Suspensão de Ac e Ag diluídos
Princípio partículas em suspensão – desvio de luz incidida dispersão de luz incidente quantificada por um detector Fonte de luz Suspensão de Ac e Ag diluídos Raios de luz focados Raios de luz desviados e refletidos Detector

26 Nefelômetro acoplado a computador
Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, xenônio, hélio- neônio ou laser concentração - curva padrão Nefelômetro acoplado a computador

27 Ag+Ac em suspensão – luz transmitida Detector - espectrofotômetro
Turbidimetria Ag+Ac em suspensão – luz transmitida Detector - espectrofotômetro Vantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e automatizada Desvantagens: não pode ser usada em amostras muit turvas Uso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albumina Fonte de luz branca Espectrofotômetro de fibra óptica Absorção e espectro de luz desviada e refletida

28 Técnicas de Aglutinação

29 Aglutinação - complexo Ag-Ac - agregados visíveis - semi-quantitativa – 500x mais sensível que precipitação - sensibilização de suporte – látex, hemácias - vantagens: < custo, facilidade e rapidez - desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado e acessibilidade - vários tipos de sistemas

30 Fatores interferentes
- classe de Ac - IgM 750 vezes mais eficiente que IgG - eletrólitos - pH ( ideal entre 6,0 e 8,0)‏ - tempo - temperatura - estabilidade da ligação ao suporte (adsorção)‏ - concentração de Ag ou Ac (falso -)‏

31 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ag ou Ac adsorvido a partícula/célula Facilita a visualização do imunocomplexo Ag-Ac Tipos de reações Aglutinação Direta Inibição da aglutinação direta / hemaglutinação Aglutinação Indireta ou Passiva Hemaglutinação passiva Inibição da aglutinação passiva / hemaglutinação Reação de microflocução

32 Aglutinação direta - partículas antigênicas insolúveis íntegras ou fragmentadas - Ag presente na partícula / célula – hemácias, bactérias, protozoários e fungos - realizado em tubo ou lâmina - Uso: identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose, leptospirose - para a identificação de ANTÍGENOS (teste DIRETO)‏

33 AGLUTINAÇÃO DIRETA Ac do soro Ag íntegro ou fragmentado aglutinação

34 Resultado positivo Ag eritrocitário Ac Anti- eritrócito
Reagente de Coombs

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37 Tipagem de Sangue – direto (pesquisa de antígeno)
B AB O

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39 Aglutinação indireta ou passiva
- Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes - hemácias – hemaglutinação - um dos melhores suportes - outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose - detecta IgG e IgM / tratamento com 2-ME - lâmina ou microplaca em “V” ou “U” Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide (FR), proteína C reativa (PRC), ASLO

40 Esquema de realização de testes de aglutinação em placa –
teste de Látex (testes rápidos)‏

41 Aglutinação indireta (passiva)‏

42 AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVA
Ac do soro Ag solúvel adsorvido ao suporte aglutinação

43 Aglutinação Indireta

44 HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
Ac do soro Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)‏ aglutinação

45 Hemaglutinação passiva
Ac do soro Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)‏ Aglutinação

46 Reação de microfloculação
- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)‏ - RPR (Rapid Plasm Reagin)‏ - suporte: cristais de colesterol - Ag: cardiolipina - placas escavadas - Uso: pesquisa de reaginas

47 REAÇÃO DE MICROFLOCULAÇÃO
Ac da Amostra Suspensão antigênica: cardiolipina, colesterol e lecitina aglutinação Reação Positiva=

48 Resultado VDRL Reação negativa Reação positiva Microscópio óptico 100x

49 Reação de fixação de complemento (RFC)‏
– Boret e Gengou - qualitativo: sistema homogêneo de duas etapas – Mayer e cols. – quantitativo – Wassermanmn e Levine – micrométodo quantitativo - 1a etapa: interação Ag-Ac na presença de complemento - 2a etapa: adição do sistema indicador (Hc+hemolisina)‏ difícil execução: reagentes padronizados - uso: doença de Chagas, sífilis, neurocisticercose

50 Complemento liga-se ao complexo Ag- Ac Complemento não ligado
Soro com Ac Soro sem Ac Ag liga-se ao Ac Ag não ligado Complemento liga-se ao complexo Ag- Ac Complemento não ligado Indicador - Hemácias sensibilizadas com hemolisinas Indicador - Hemácias sensibilizadas com hemolisinas Hemácias íntegras no pellet Não houve lise Hemácias lisadas pelo complement o não ligado Hemólise Reativo Não reativo

51 + + REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Ag sem hemólise Ac do soro
sistema indicador + complemento

52 Agradecimentos Profa Adriana de Brito Profa Paula Knox Pelo material gentilmente cedido Referências Bibiolgráficas FERREIRA, AW & ÁVILA, SL Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes, Atualização – pesquisa na internet setembro de 2013.

53 Obrigada, Profa Alessandra