MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES

Apresentação em tema: "MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES"— Transcrição da apresentação:

1 MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES

2 DIAGNÓSTICO DAS PARASITOSES
Métodos diretos - aqueles em que é possível identificar diretamente a presença do parasito ou seus produtos. a) exames a fresco para pesquisa de trofozoítos nas fezes; b) métodos de colorações que apresentam maior especificidade para identificação de estruturas parasitárias (morfologia); c) métodos de concentração que aumentam a sensibilidade e consistem em centrifugação em variadas soluções, preparo em soluções de diferentes densidades ou temperaturas e sedimentação espontânea; d) isolamento e cultura para alguns protozoários, em meios de cultura e inoculação em animais de laboratório; e) detecção de material genético (DNA, RNA) parasitário;

3 DIAGNÓSTICO DAS PARASITOSES
Métodos indiretos - aqueles métodos que detectam a resposta imunológica do hospedeiro. Em algumas infecções parasitárias, o diagnóstico direto é dificultado, como, por exemplo, toxoplasmose, doença de Chagas (fase crônica), abscesso amebiano, leishmaniose visceral, esquistossomose (fase crônica), cisticercose e hidatidose. Nesses casos, o diagnóstico imunológico indireto de detecção de anticorpos produzidos pelo hospedeiro são de grande importância

4 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Formação de agregados visíveis como resultado da interação de Ac específicos e partículas insolúveis que contenham determinantes antigênicos em sua superfície. Pode ocorrer em: aglutinação direta - partículas que apresentem Ag naturais de superfície (hemácias, bactérias, protozoários) podem ser aglutinados diretamente por Ac. aglutinação indireta - partículas inertes (látex) ou hemácias podem ser sensibilizadas por adsorção de Ag.

5 TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO
A reação de hemaglutinação é uma técnica para a detecção de anticorpos específicos que, quando presentes, reconhecerão antígenos presentes na superfície de eritrócitos, causando aglutinação. Usa-se hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, sensibilizadas com o Ag.

6 TESTE DE AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
Usado na detecção de Ag ou Ac Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser usadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e Ag polissacarídicos

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8 TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem a fluorocromos. Fluorocromos: substâncias que absorvem luz UV e emitem luz visível fluorescente. Teste de Imunofluorescência Direta Teste Imunofluorescência Indireta

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10 IFD positivo para G. duodenalis
Reação de imunofluorescência direta positiva mostrando formas amastigotas do parasito em esfregaço de aspirado de linfonodo de cão naturalmente acometido por leishmaniose visceral, marcadas pelo anticorpo anti-Leishmania conjugado com fluoresceina.

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14 Imunofluorescência Indireta (IFI)

15 IFI para T. gondii: (A) positivo e (B) negativo
IFI positivo para T. cruzi

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17 TESTE DE ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay em português Ensaio Imunoenzimático.
É um dos métodos imunológicos mais utilizados para quantificar a concentração de Ag e Ac, por apresentar grande sensibilidade e especificidade. Nesse método, uma enzima é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Caso ocorra esse reconhecimento, a enzima irá reagir com um substrato incolor para produzir um produto colorido. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a presença de produto colorido indica a presença de antígeno.

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19 ELISA Direto: detecta Ag
ELISA Indireto: detecta Ac

20 Interpretação dos resultados: espectrofotômetro (absorbância)
leitura visual espectrofotômetro (absorbância)

21 ELISA Direto: detecta Ag
ELISA Indireto: detecta Ac

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23 WESTERN BLOTTING É um procedimento no qual as proteínas são separadas pelo tamanho por eletroforese e, após a separação, transferidas para uma membrana de nitrocelulose, onde ficam imobilizadas. Essa membrana é utilizada como suporte sólido para um ensaio imunoenzimático in situ, semelhante ao método da imunoperoxidase. Esta técnica pode ser empregada para a pesquisa de antígenos ou de anticorpos, sendo um importante auxiliar no diagnóstico de doenças infecciosas.

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28 SENSIBILIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente positivos em indivíduos comprovadamente infectados ESPECIFICIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente negativos em indivíduos comprovadamente sadios EFICIÊNCIA: concordância dos resultados verdadeiros positivos e negativos em indivíduos com e sem infecção VALOR PREDITIVO POSITIVO: probabilidade do resultado positivo ser verdadeiramente positivo VALOR PREDITIVO NEGATIVO: probabilidade do resultado negativo ser verdadeiramente negativo

29 Métodos Moleculares no Diagnóstico das Parasitoses Humanas

30 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) - 1983
O desenvolvimento da PCR foi possível graças à descoberta de uma enzima termoestável com atividade de polimerase (Taq DNA polimerase) isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, a qual promove a síntese de DNA in vitro . A PCR apresenta-se como um método de extrema sensibilidade, permitindo a geração exponencial de cópias de seqüências específicas a partir de um DNA molde, por meio de uma síntese enzimática in vitro. Resumidamente, pela alternância de ciclos de temperatura da reação promove-se a desnaturação da fita molde, ligação dos iniciadores e extensão das novas cadeias de DNA pela ação da Taq DNA polimerase, resultando em cópias exatas do segmento-alvo.

31 Dada a sua grande capacidade de síntese, a PCR é capaz de amplificar até 4 x 106 vezes uma dada seqüência de DNA molde de dupla fita em 25 ciclos de reação. Após sua rápida difusão no meio científico, a PCR tem sido amplamente utilizada na detecção e caracterização de agentes etiológicos de importantes parasitoses humanas, como, por exemplo, T. cruzi, Leishmania spp., Plasmodium spp., Wuchereria bancrofti, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Taenia spp., Toxoplasma gondii, Schistosoma mansoni e Fasciola hepatica

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35 OBJETIVO DA PCR É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucleico, a partir de uma fita molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro.

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47 MARCADORES IMUNOLÓGICOS NO DIAGNÓSTICO
DE ALGUMAS INFECÇÕES PARASITÁRIAS- De Carli – cap. 29 Trabalhar o artigo: