Seleção de Transconjugantes

Apresentação em tema: "Seleção de Transconjugantes"— Transcrição da apresentação:

1 Seleção de Transconjugantes

2 Tópicos a abordar: Resultados da aula anterior Tipos de antibióticos
Encontro entre bactérias Bactéria dadora Bactéria recetora Transconjugantes

3 População da placa de conjugação
Meios de cultura -Tipos de meios de cultura -Exemplos de meios de cultura Meio de seleção Previsão das colónias que se esperam obter Colónias âmbar Colónias vermelhas

4 Antibióticos AMC – Amoxicilina + Ácido Clavulânico
FOX – Cefoxitina (cefalosporina da 2ª geração) NA – Ácido Nalidíxico (quinolona da 1ª geração) ATM – Aztreonamo (monobactamo) KF – Cefalotina (cefalosporina da 1ª geração) FEP – Cefepima (cefalosporina da 4ª geração)

5 Aspeto inicial das placas
999 K802N

6 Aspeto inicial das placas
405 405

7 Resultados da aula anterior
405 999 K802N AMC (amoxicilina + clavulânico) 4 mm RESISTENTE SENSÍVEL 0 mm NA (ácido Nalidíxico) 23 mm 24 mm ATM (aztreonamo) 1 mm Sinergismo com AMC FEP (cefepima) 18 mm FOX (cefoxitina) 8 mm 25 mm KF (cefalotina) 10 mm

8 Resultados da aula anterior
Resistente Intermédio Sensível Classe AMC (amoxicilina + clavulânico) ≤ 13 mm 14 – 16 mm ≥ 17 mm Penicilinas NA (ácido Nalidíxico) 14 – 18 mm ≥ 19 mm Quinolonas ATM (aztreonamo) ≤ 15 mm 16 – 21 mm ≥ 22 mm Monobactamos FEP (cefepima) ≤ 14 mm 15 – 17 mm ≥ 18 mm Cefalosporina B FOX (cefoxitina) KF (cefalotina) ≤ 14 mmm Cefalosporina A

9 β - Lactâmicos Anel β–Lactâmico
Inibem a síntese da parede celular bacteriana, por inibição das transpeptidases

10 Penicilinas Anel β-Lactâmico associado a um anel de tiazolidina
Ativas contra bactérias Gram positivo, não produtoras de β- lactamases e com fraca atividade contra bactérias Gram negativo

11 Amoxicilina (AMX) β-lactâmico de espectro moderado utilizado no tratamento de infeções bacterianas

12 Cefalosporinas Anel β-lactâmico associado a uma molécula de dihidrotiazina Atividade contra bactérias Gram negativo Resistentes a β-lactamases estafilocócicas 1ª, 2ª, 3ª,4ª geração

13 Cefoxitina Cefalosporina 4ª geração
Menos ativa que as primeiras contra cocos Gram positivo Moderadamente resistentes às beta-lactamases dos bacilos Gram negativo

14 Cefepima Largo espectro
Estáveis contra beta-lactamases de largo espectro Colmatam deficiências das cefalosporinas da 3ª geração

15 Cefalotina Cefalosporinas da primeira geração
Maior atividade contra bactérias de Gram positivo do que Gram negativo

16 Monobactamos Inibem a síntese da parede bacteriana Inibidores de
bactérias Gram negativo

17 Aztreonamo β-lactâmico monocíclico Molécula anfotérica
Espectro de actividade: Com atividade: bacilos Gram negativo anaeróbios Sem atividade: bactérias Gram positivo, aeróbios restritos

18 Quinolonas São efetivos contra Gram-negativos e positivos
Inibição do DNA girase e de topoisomerase IV Ácido nalidíxico: inibe a síntese dos ácidos nucleicos

19 Encontro bacteriano: Conjugação MAS COMO SE FAZ?
Conjugação é a transferência de DNA plasmídico de uma bactéria dadora para uma bactéria recetora “Mating” designa o contacto físico entre a bactéria dadora e a bactéria recetora MAS COMO SE FAZ?

20 Procedimento: Técnica Assética Em caldo
Misturam-se 100 μl da bactéria dadora e da bactéria recetora num cado fresco. Em agar Numa placa de gelose aplicam-se 100 μl da bactéria recetora sob a forma de gota. Aplicam-se da mesma forma 100 μl da bactéria dadora superiormente à recetora. Técnica Assética

21 Estirpes bacterianas Dentro das bactérias Gram negativas, as da família Enterobacteriaceae, nomeadamente Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são as principais responsáveis pelas infeções do trato urinário, devido em parte à sua grande capacidade adaptativa.

22 Bactéria Recetora Estirpe K802N: E.coli
Resistente ao ácido nalidíxico resistência codificada por mutação no DNA cromossómico Bacilo de Gram Negativo GLUC + (via ácido mista) LAC – Citocromo c oxidase – Móvel Produtora de indol Reduz nitratos a nitritos (nitrado redutase +)

23 Bactéria Dadora Estirpe 999: Klebsiella pneumoniae
Resistente à amoxicilina resistência codificada por DNA plasmídico Bacilo de Gram Negativo GLUC + (via butileno-glicólica) LAC + Citocromo c oxidase – Urease + Reduz nitratos a nitritos (nitrato redutase +)

24 Transconjugantes São as bactérias que queremos obter e isolar!!
CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS Possuem resistência ao ácido nalidíxico e à amoxicilina Possuem todo o fenótipo das bactérias recetoras

25 Que tipo de bactérias se desenvolverão na placa de gelose?
Placa de Conjugação Que tipo de bactérias se desenvolverão na placa de gelose? Bactérias Recetoras Bactérias Dadoras Transconjugantes Como passar para o meio de seleção?

26 Procedimento Técnica Assética Faz-se uma diluição em soro fisiológico
Espalha-se na placa de seleção Promove-se o crescimento bacteriano - incubação Técnica Assética

27 Meios de cultura Contêm todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento dos microorganismos, sob a forma assimilável e em concentração não inibitória

28 Meios de cultura Devem ser esterilizados e para manter a cultura pura é necessário manipulá-los recorrendo à técnica assética Podem ser classificados de acordo com o seu estado físico, composição química e objetivos funcionais Permitem manter os microorganismos viáveis no laboratório sob a forma de culturas puras

29 Meios de cultura A sua especificidade é muito importante, pois permite tirar muitas conclusões Permitem o isolamento, identificação e estudos importantes como o da sensibilidade aos antibióticos

30 Cled Diferencial para a lactose Não selectivo
CONSTITUIÇÃO: Extrato de carne Lactose Agar L-cisteína Água Diferencial para a lactose Não selectivo Indicador de pH: Azul de bromotimol Ácido: Amarelo Básico: Azul esverdeado

31 Cled

32 Mannitol Diferencial para o manitol Selectivo para as Gram (+)
CONSTITUIÇÃO: Extrato de carne peptona manitol Agar Água Elevada [NaCl] Indicador de pH: Vermelho de fenol Ácido: amarelo Básico: vermelho/rosa

33 Mannitol

34 McConkey Diferencial para a lactose Selectivo para Gram (-)
CONSTITUIÇÃO: Peptona Lactose Agar Sais biliares Cristal violeta Água Indicador de pH: Vermelho neutro Ácido: vermelho Básico: âmbar/incolor

35 McConkey

36 Meio de seleção Meio que permite que se detetem as bactérias com as características desejadas, ou seja, as resultantes da conjugação O meio deve ser seletivo: evitar contaminações e selecionar as transconjugantes

37 Mas como Meio de seleção ??
O meio deve ser o meio de McConkey com adição de antibióticos Antes da utilização o meio deve ser TESTADO ?? Mas como

38 Meio de seleção Testemunho: Teste de Viabilidade:

39 AMARELAS A MUDAR PARA VERMELHO
Previsão Quais serão as colónias que serão capazes de se desenvolver no meio de selecção ?? Que cor apresentarão ?? AMARELAS (transconjugantes) AMARELAS A MUDAR PARA VERMELHO VERMELHAS

40 Colónias Amarelas Recetoras:
Degradação progressiva da amoxicilina pelas β-Lactamases provoca níveis cada vez mais baixos de antibiótico As recetoras conseguem desenvolver-se Crescem à volta das verdadeiras transconjugantes Verdadeiras transconjugantes

41 Colónias Vermelhas Transconjugantes:
- Mudança de cor devido à acidificação do meio de cultura (degradação do antibiótico) Dadoras: - Ocorrência de uma mutação espontânea

42 “As bactérias são melhores engenheiros genéticos que o Homem e vão continuar a escapar ao efeito dos antibióticos.”