Procesamento downstream

Apresentação em tema: "Procesamento downstream"— Transcrição da apresentação:

1 Procesamento downstream
Aluna: Flávia Cristina Saraiva Chibebe

2 Processamento downstream
A viabilidade da produção e comercialização de biomoléculas depende do custo do produto Cerca de 50 a 90% do custo da produção da biomolécula corresponde as etapas de purificação

3 Processamento downstream
“Downstream processing“ → grupo de técnicas, tais como a centrifugação, filtração e cromatografia, usadas para recuperar e purificar os produtos de uma conversão enzimática ou de um processo de produção microbiológica.

4 Etapas do processamento
Separação de células Proteínas Intracelulares Fermentação → coleta e reconhecimento das células (centrifugação ou filtração)→ ruptura ( homogenização → uma suspensão de células é submetida a atravessar um orifício de diâmetro interno estreito, sob alta pressão ou agitação na presença de abrasivos, como cacos de vidro) → centrifugação (para separação dos fragmentos celulares)

5 Etapas do processamento
Proteínas extracelulares As etapas iniciais do processamento Downstream são menos complexas Fermentação → remoção das células por centrifugação ou filtração

6 Etapas do processamento
Concentração do produto protéico Pequenos volumes são mais convenientes para se trabalhar Métodos: Indução da precipitação do produto utilizando, por exemplo, sais como sulfato de amônio ou solventes como o etanol. Ultrafiltração.

7 Etapas do processamento
Ultrafiltração É um método popular de concentração devido aos seguintes fatores: Altas taxas de recuperação do produto Processo rápido Equipamento para scale-up do processo já está disponível, e os custos são relativamente acessíveis.

8 Etapas do processamento
Purificação As técnicas de purificação são baseadas nas características físico-químicas das proteínas, tais como tamanho, carga, solubilidade, hidrofobicidade. Estagios: - design: é uma série de etapas de purificação, onde deve-se conhecer: qual é o maior contaminante, informações detalhadas da origem do produto e dos contaminantes, características físicas do produto. - scale-up: processo empregado para converter um procedimento laboratorial em industrial, mediante aspectos econômicos → produto de alta qualidade e competitivo no mercado.

9 Etapas do processamento
Etapas da cadeia de purificação: - captura do produto de interesse; - remoção da maior parte dos contaminantes (incluindo DNA); -remoção de todos os vestígios de contaminantes e formas variáveis do produto de interesse.

10 Métodos de purificação
Filtração - A eficiência deste método depende da natureza física das partículas do produto; - Pode ser usada antes da primeira etapa de purificação, com o objetivo de concentrar a biomassa; Ultrafiltração: moléculas de tamanhos diferentes são separadas pela passagem, sob pressão, de uma dirpersão sobre uma membrana com poros de tamanho definido. Está técnica é aplicada para a separação de macromoléculas ou de vírus.

11 Métodos de purificação
Centrifugação - Também depende da natureza física do produto de interesse; - Permite o isolamento eficiente de partículas subcelulares e organelas em suspensão num líquido viscoso; - Esta técnica utiliza um fluido viscoso, com gradiente de densidade constante. Após a centrifugação, as diferentes frações podem ser removidas.

12 Métodos de purificação
Precipitação - Método simples e relativamente econômico, mas não muito utilizado para purificação de proteínas recombinantes em larga escala, pois faz uso de agentes que devem ser eliminados depois; - Pode ocorrer por “salting-out”, que é a precipitação devido ao aumento da força iônica do meio (sulfato de amônio) - Também pode ocorrer por mudança da constante dielétrica, utilizando uma mistura de água + solvente orgânico (ex: polietilenoglicol, ácido tricloroacético).

13 Métodos de purificação
Cromatografia - É baseado na separação de 2 fases: fase estacionária e fase móvel Fase estacionária ideal: Alta força mecânica, alta porosidade, alta capacidade, biocompatibilidade e estabilidade da matriz frente a uma variedade de solventes.

14 Métodos de purificação
Cromatografia por adsorção Cromatografia por troca iônica Cromatografia de interações hidrofóbicas Cromatografia de permeação em gel Cromatografia de afinidade

15 Métodos de purificação
Cromatografia de afinidade É baseado em interações específicas entre um ligante imobilizado e a proteína de interesse. Sob condições fisiológicas ocorre a ligação da proteína com o ligante. Em seguida, lava-se a matriz com a finalidade de remover contaminantes. Assim, a proteína purificada pode ser recuperada através da adição de ligantes que competem pela fase estacionária ou de mudanças nas condições físicas, reduzindo a afinidade.

16 Métodos de purificação
Vantagens: a alta especificidade e a combinação de concentração e purificação em um só passo. Desvantagens: a ligação da proteína desejada com a seqüência adicional pode ser muito forte, necessitando de condições severas para a separação desse complexo.

17 Considerações para a produção e purificação de proteínas
1. Heterogeneidade de N- e C-terminais É muito importante o uso de métodos que gerem proteínas com um NH2-terminal como o encontrado na proteína autêntica. Quando as proteínas não são produzidas de forma correta, o produto final pode ser uma mistura de diversas variáveis da proteína em questão ou mesmo conter proteínas faltando um ou mais resíduos de amino-terminal. Isso é chamado de heterogeneidade de amino-terminal. A heterogeneidade de amino- e/ou carboxi-terminal não é desejável, uma vez que pode causar dificuldades na purificação e caracterização das proteínas.

18 Considerações para a produção e purificação de proteínas
2. Modificação química/ Alterações conformacionais Transcritos que contêm a seqüência inteira de códigos podem resultar em isômeros conformacionais da proteína por causa da estrutura secundária inesperada que afeta a fidelidade da tradução. Além de alterações conformacionais, as proteínas também podem sofrer mudanças químicas durante o processo de purificação. Essas alterações podem resultar em desnaturação parcial da proteína. Por outro lado, a desnaturação da proteína pode ser a causa das alterações químicas.

19 Considerações para a produção e purificação de proteínas
3. Glicosilação Muitas proteínas terapêuticas produzidas pela técnica do DNA recombinante são glicoproteínas. A presença e a natureza dos oligossacarídeos nas proteínas afeta muitas características importantes, entre as quais o tempo de meia-vida, solubilidade, estabilidade e, às vezes, até mesmo a função farmacológica.

20 Considerações para a produção e purificação de proteínas
4. Processamento proteolítico As proteases exercem um importante papel no processamento, maturação, modificação ou isolamento de proteínas recombinantes. Se a célula morre, as proteases são soltas e sofrem lise. Portanto, é importante controlar o crescimento e as condições de cultivo para minimizar esse efeito.

21 Considerações para a produção e purificação de proteínas
5. Formação de corpo de inclusão na proteína Na bactéria normalmente proteínas solúveis podem formar inclusões granulares no citoplasma. Essas inclusões provavelmente ocorrem pelo acúmulo de agregados de proteínas amorfas que se mantêm unidas por ligações covalentes e não-covalentes. Com a presença dessas inclusões, podem ocorrer problemas na purificação e na solubilidade da proteína.

22 Bibliografia BIBLIOGRAFIA
Walsh, G. – Biopharmaceuticals, Biochemistry and Biotechnology, 2ª edição, Ed. Wiley, 1998, p