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ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP Disciplina: Engenharia Bioquímica II A Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro Profº Arnaldo.

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1 ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP Disciplina: Engenharia Bioquímica II A Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro Profº Arnaldo Márcio

2 Etapas de um Processo de Purificação

3 Etapa do processoOperações unitáriasPrincípio Clarificação Filtração convencionalTamanho de partículas CentrifugaçãoTamanho e densidade de partículas Filtração tangencial (membranas)Tamanho de partículas FloculaçãoHidrofobicidade de partículas Rompimento de células H omegeneizaçãoCisalhamento Ultra-somCisalhamento Moagem em moinho de bolasCisalhamento Rompimento químico ou enzimático Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular Purificação de baixa resolução PrecipitaçãoSolubilidade U Itrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas Extração em sistemas de duas fases líquidasSolubilidade, massa molar Purificação de alta resolução Cromatografia de troca-iônica Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula Cromatografia de afinidade (biológica ou química) Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção) Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo) Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade Cromatografia de exclusão molecularMassa molar Membranas adsortivas Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína Tratamentos finais Cristalização Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido Liofi I izaçãoCaracterísticas de equilíbrio líquido-sólido SecagemCaracterísticas de equilíbrio líquido-sólido

4 Rompimento Celular Suspensão Celular Clarificação Rompimento Celular Produtos Intracelulares Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento

5 Aplicados após a separação e lavagem das células; Células animais (possuem apenas membrana), fácil rompimento com baixa força de cisalhamento; Ex.: Células animais: rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade

6 Forma mais adequada de Rompimento? Tipo de microrganismo Tamanho da célula; Tolerância a tensões de cisalhamento; Necessidade de controle de temperatura; Gasto de energia;

7 Parede Celular

8 Métodos de Rompimento Celular Homogeneizador de alta pressão Moinho de bolas Ultrassom Mecânicos Choque osmótico Congelamento-descongelamento Aquecimento Secagem Não- mecânicos Álcalis Solventes Detergentes Ácidos Químicos Lize enzimática Enzimáticos

9 Homogeneizador a alta pressão Cavitação Turbulência Cisalhamento

10 Mecânico - Homogeneizador a alta pressão Este tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração Pressões utilizadas podem variar de 5000 a psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida).

11 Mecânico - Homogeneizador a alta pressão O desempenho pode ser afetado por: Pressão de operação; Velocidade de alimentação; Temperatura; Estado fisiológico do microrganismo; Condições de cultivo; Tipo de célula e sua concentração. tamanho das células (maior => rompimento mais fácil) pressão (maior => maior eficiência) número de passagens (múltiplas etapas aumenta o ren- dimento)

12 Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1 a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:

13 log R m = k. N. P a (R m – R) onde: R m é a concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/L) R é a concentração de proteina liberada (g/L) k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célula N é o número de passagens P é a pressão a é constante que depende do tipo de microrganismo e das condições de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)

14 Mecânico – Moinho de Bolas Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro. O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células.

15 Mecânico – Moinho de Bolas

16 Mecânico – Ultra-som O rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20kHz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação. Escala de laboratório.

17 Mecânico - Ultrassom

18 Rompimentos Mecânicos Desvantagens: As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas; Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.


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