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Pesquisador Prodoc: Humberto Actis Zaidan Responsável Institucional: Karina Gramacho Instituição Hospedeira: Ceplac/Cepec Departamento: Seção de Fitopatologia.

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1 Pesquisador Prodoc: Humberto Actis Zaidan Responsável Institucional: Karina Gramacho Instituição Hospedeira: Ceplac/Cepec Departamento: Seção de Fitopatologia Instituição Parceira: UESC/DCB Área: Agronegócios/Cacau

2 Caracterização molecular da resistência do cacaueiro (Theobroma cacao L.) à vassoura de bruxa e à podridão parda* *Projeto financiado pela FAPESB – Convênio 76/2002-Prodoc 1

3 Objetivos do Projeto Identificar e caracterizar molecularmente genes associados à resistência de frutos de cacau à vassoura de bruxa (VB) Construção de primers específicos para genes de resistência visando a seleção indireta de plantas resistentes Caracterização de diferentes acessos de cacaueiro quanto à presença/ausência de genes de resistência

4 Introdução Em 1989 foi detectado o primeiro foco de vassoura de bruxa no sul da Bahia Em 1990, o Brasil era o segundo maior produtor mundial de cacau Em conseqüência do avanço dessa doença, o Brasil caiu para o sexto lugar no ranking e passou de exportador a importador de cacau O que resultou em mudanças no uso da terra, venda de propriedades, aumento do desemprego e danos ao meio ambiente Em 2005, a lavoura recuperou-se um pouco, principalmente devido a clonagem de plantas resistentes à doença

5 Fonte: Revista Veja, 26 de abril de 2006

6 Material e Métodos Foram inoculados com Crinipellis perniciosa (Cp) frutos de três variedades de cacau: -TSH1188 resistente a VB -TSH565 medianamente resistente -Catongo suscetível Com polinização controlada, e cerca de 40 dias de idade

7 Foram testadas diferentes formas de inoculação (copinho de massa de modelar, disco de papel filtro, e spray), utilizando-se diferentes concentrações de inóculo (1x10 5 ; 2x10 5 ; e 1x10 6 esporos/mL

8 Após a inoculação, os frutos foram ensacados, e amostras da casca dos frutos foram coletadas, no local inoculado, com três repetições, nos seguintes intervalos de tempo: 24, 48, e 72 horas; 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 dias

9 As amostras de casca colhidas foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido, identificadas, e armazenadas em freezer -80ºC

10 Posteriormente, as amostras colhidas nos diferentes intervalos de tempo, foram moídas conjuntamente em nitrogênio líquido, mas separadamente por variedade

11 O RNA da casca dos frutos de TSH-1188 inoculado com Cp foi extraído, sendo aplicado em gel de agarose 1% para verificar a qualidade do mesmo

12 A biblioteca de cDNA de casca de fruto TSH-1188 inoculado com Cp, foi construída utilizando-se o Kit Creator Smart cDNA Library Construction (Clontech)

13 A biblioteca de TSH-1188 inoculado com Cp foi plaqueada em meio LB contendo Cloranfenicol, as melhores colônias foram selecionadas, transferidas para 40 microplacas de 96 poços, sendo a seguir feitos os minipreps e reações de sequenciamento

14 As 10 primeiras microplacas foram seqüenciadas no MegaBace (Amersham) da UESC E outras 30 microplacas foram sequenciadas no ABI3100 (Applied Biosystems) do CEPEC/CEPLAC, adquirido com recursos do FINEP

15 As seqüências obtidas, a partir da biblioteca de cDNA de casca de frutos TSH-1188 inoculados com Cp, foram analisadas no Laboratório de Bioinformática da UESC, por Nicolas Carels, tendo sido selecionadas (33%), que preenchiam os seguintes pré-requisitos: - qualidade Phred>10 - seqüências com comprimento >90pb - não correspondiam a seqüência do vetor - não correspondiam a cauda polyA

16 Essas seqüências selecionadas formaram 191 Contigs e 675 seqüências simples não redundantes, sendo 866 a soma de ambos As 866 seqüências foram comparadas com os seguintes bancos de dados públicos: – Proteínas não redundantes “nr” através do Blast-X (GenBank - NCBI) –ESTs de Cacau Verica et al (Plant Cell Reports, 23: ) – ESTs de Cacau de Jones et al (Planta, 216: )

17 Resultados Alcançados Sintomas de VB em TSH1188 Inoculado TSH1188 Inoculado Assintomático

18 Sintomas de VB em Catongo Inoculado com Cp na concentração 1x10 5 esporos/mL pelo método do copinho

19 Sintomas de VB em Catongo Inoculado com Cp na concentração 1x10 6 esporos/mL, pelo método do Spray

20 Comparação com o Banco de Dados de Proteínas Não Redundantes “nr” (Blast-X) Das 866 sequências estudadas: (64%) apresentaram homologia com “nr” (36%) não mostraram homologia (no hits) Das sequências previamente selecionadas: - 11 (0,9%) tiveram homologia com sequências de proteínas de fungos - Destas 11, apenas 9 (0,7%) apresentaram homologia com as sequências do banco de dados do genoma de Crinipellis perniciosa

21 Comparação através do Blast com o banco de dados de ESTs de Cacau Das 866 sequências comparadas com os ESTs de Cacau de Verica et al. 2004: (13%) apresentaram homologia (87%) não Das 866 sequências comparadas com os ESTs de Cacau de Jones et al. 2002: (17%) apresentaram homologia (83%) não

22 Comparação entre “nr”, Verica e Jones De 314 sequências “no hits”, sem homologia no banco de dados de proteínas não redundantes “nr”, 41 (13%) apresentaram homologia com os ESTs de Verica e/ou Jones Jones Verica No Hits “nr”

23 De 552 sequências com homologia no banco de dados “nr”, 223 (40%) também tiveram homologia com os ESTs de Verica e/ou Jones Verica Jones Hits “nr”

24 Foram encontradas homologias com as seguintes classes de proteínas, entre outras: Pathogenesis-related proteins – proteínas de plantas que são induzidas em situações patológicas ou relacionadas, –Algumas possuem propriedades antifúngicas Anotação Blast-X

25 Proteínas E-value Avr9/Cf-9 rapidly elicited protein 141 [Nicotiana tabacum]1,00E-17 Putative pathogenesis related protein 1 precursor (Vitis vinifera), PR-1 6,00E-30 Pathogenesis-related protein [Pyrus pyrifolia]1,00E-57 Pathogenesis-related protein 4B [Nicotiana tabacum], PR-4B 2,00E-57 Pathogenesis-related thaumatin family protein [Arabidopsis thaliana], PR-5 4,00E-07 Putative pathogenesis-related protein (U20347) [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 5,00E-31 Thaumatin-like protein [Sambucus nigra], PR-52,00E-43 Osmotin-like protein linusitin [Linum usitatissimum], PR-5d8,00E-19 Beta-1,3-glucanase [Salix gilgiana], PR-2 9,00E-39 Peroxidase [Arabidopsis thaliana], PR-97,00E-08

26 Enzimas da via metabólica Fenilpropanóide ProteínasE-value Phenylalanine ammonia lyase - PAL [Citrus clementina x Citrus reticulata] 1,00E-155 Chalcone synthase [Hypericum androsaemum]1,00E-74 Flavonol_synthase_[Ginkgo_biloba] 2,00E-48

27 Estresse oxidativo: resposta de defesa da planta após o reconhecimento do patógeno, conduzindo a reação de hipersensibilidade Esta resposta é devido à geração de espécies ativas de oxigênio (ROS), tal como H 2 O 2, O 2 -, e OH - Peróxido de hidrogênio pode ser diretamente tóxico ao patógeno e está envolvido com o fortalecimento da parede celular, uma vez que é necessário para a biossíntese de lignina Fonte: Resende et al., 2003 (Fitopatol. Bras.,v.28, n.2)

28 ProteínasE-value Peroxidase [Arabidopsis thaliana], PR-97,00E-08 Monodehydroascorbate reductase [Arabidopsis thaliana]3,00E-25 Putative CuZn-superoxide dismutase (Populus tremula x P.tremuloides) 3,00E-18 Superoxide dismutase [Fagus sylvatica]2,00E-58 Peroxiredoxin [Populus tremula x Populus tremuloides]2,00E-68

29 Outras proteínas importantes Proteínas E-value Serine/threonine protein kinase putative [Arabidopsis thaliana) 4,00E-25 S-adenosyl-L-methionine synthetase [Elaeagnus umbellata] 1,00E-37 Leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative [Arabidopsis thaliana] 1,00E-10 Lectin-related [Arabidopsis_thaliana] 1,00E-23 Caffeine synthase (Camellia_sinensis)3,00E-45 Cytochrome P450 monooxygenase [Glycine_max] 5,00E-67 Ubiquitin family protein [Arabidopsis thaliana]5,00E-35 Heat-shock protein 80 [Euphorbia esula]2,00E-56 Metallothionein-like protein [Gossypium hirsutum]7,00E-24

30 Divulgação Zaidan*, H. A., Gramacho, K. P., Silva, S. M., Damaceno, V. O., Rios, V. P., Cruz*, A. P. & Reis, J. Avaliação de métodos de inoculação de Crinipellis perniciosa em frutos de cacau 1 (Projeto 1 e Bolsas* Financiados pela Fapesb - Convênio 76/2002-Prodoc) XXXVIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Brasília-DF, 1-5 agosto, 2005.

31 Zaidan*, H. A., Gesteira*, A. S., Ceita, G. O., Cascardo, J. M., Carels, N., Costa*, E. A., Lima*, L. S., Serra*, W. O., Braz*, N. R. & Gramacho, K. P. Caracterização molecular da resistência do cacaueiro (Theobroma cacao L.) à vassoura-de-bruxa 1 (Projeto 1 e Bolsas* Financiados pela FAPESB - Convênio 76/2002- Prodoc) XXXVIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Brasília-DF, 1-5 agosto, 2005.

32 Zaidan*, H. A.; Gesteira*, A. S.; Ceita, G. O.; Carels, N.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J. C. M.; Costa*, E. A.; Lima*, L. S.; Serra*, W. O.; Braz, N. G. R.; Gramacho, K. P. Biblioteca de interação Crinipellis perniciosa X frutos de cacau 1 (Projeto 1 e Bolsas* financiados pela FAPESB, Convênio 76/2002-Prodoc). Workshop da Vassoura de Bruxa, UESC, Ilhéus-Ba, 30 novembro a 02 dezembro, 2005.

33 Zaidan,H.A.*; Gramacho, K.P.; Gesteira, A.S.*; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa, E.A.*; Lima, L.S.*; Serra, W.O.*; Braz, N.G.R.* Molecular analysis of the interaction between cocoa pods and Crinipellis perniciosa 1 ( 1 Project and *Fellowship supported by FAPESB, Agreement 76/2002-Prodoc). 15 TH INTERNATIONAL COCOA RESEARCH CONFERENCE, San José, Costa Rica, Outubro, (Submetido)

34 Zaidan*,H.A.; Gramacho, K.P.; Gesteira*, A.S.; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa*, E.A.; Lima*, L.S.; Serra*, W.O.; Braz*, N.G.R. Análise molecular da interação entre frutos de cacau e Crinipellis perniciosa. (Projeto 1 e Bolsas* financiados pela FAPESB, Convênio 76/2002- Prodoc). XXXIX Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Salvador-Ba, agosto, (Submetido)

35 Zaidan,H.A*.; Gramacho, K.P.; Gesteira, A.S*.; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa, E.A.*; Lima, L.S.; Serra, W.O.*; Braz, N.G.R.* Molecular analysis of the interaction between cocoa pods and Crinipellis perniciosa 1 ( 1 Project and *Fellowship supported by FAPESB, Agreement 76/2002-Prodoc). Artigo científico em fase de elaboração para ser enviado para publicação em Periódico Internacional Qualis A

36 Impactos Este foi o primeiro trabalho a identificar possíveis genes de resistência à vassoura de bruxa em casca de frutos de cacau, o que vem gerando novos conhecimentos, publicações e mais trabalhos na mesma linha de pesquisa Foram treinados alunos de iniciação científica e técnicos, bolsistas da Fapesb, que hoje continuam a trabalhar na área de pesquisa

37 Como continuidade dos objetivos deste projeto, podemos citar a Dissertação de Mestrado de Lívia Santos Lima (ex-técnica projeto Prodoc), iniciada em 2005, que está em andamento na UESC: – Mapeamento de genes de resistência obtidos pela genômica da interação cacau- crinipellis, aplicados à programas de melhoramento. (Mestrado em Genética e Biologia Molecular da UESC). Co-orientada por Karina Gramacho, Orientada por Profa. Fabienne Micheli.

38 Aplicação Os resultados deste projeto estão permitindo um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na interação cacau-crinipellis O que está sendo de grande importância para traçar estratégias eficientes para o desenvolvimento de clones de cacaueiro com resistência efetiva e durável à vassoura de bruxa A partir dos genes seqüenciados, foram construídos 30 primers específicos para os genes de resistência identificados, o que permitirá a caracterização de diferentes acessos de cacaueiro quanto à presença/ausência desses genes (parte da Dissertação Lívia)

39 Agradecimentos FAPESB Bolsistas do projeto CEPLAC UESC FINEP


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