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Microscopia de alta resolução que pode oferecer uma resolução maior que 200nm. Resolução é a distancia mínima entre dois pontos para que estes apareçam.

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1 Microscopia de alta resolução que pode oferecer uma resolução maior que 200nm. Resolução é a distancia mínima entre dois pontos para que estes apareçam individualizados. R = λ /(2NA) A resolução de um microscopio de luz está limitada pela difração e algumas tecnicas tem sido desenvolvidas para superar essas limitações Apesar da resolução de um microscopio de luz ser fundamentalmente limitada pela difração em aproximadamente metade do comprimento de onda da luz, atualmente algumas tecnicas tem sido Structured Illumination Microscopy -- SIM Campo aberto SIM

2 Conceito da SIM

3 Uma estrutura em forma de grade é colocada no plano do diafragma e pode ser vista nitidamente no plano da objetiva.

4 GUSTAFSSON, M.G.L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy, Vol. 198, Pt 2, May 2000, pp. 82±87. A iluminação estruturada não vai alterar fisicamente essa região observável mas vai mover informações que estão fora dessa região para dentro dela.

5 Aplicações: Amostras muito espessas prejudicam a aquisição de um boa imagem. Isso porque as fluorescências dos diferentes planos da amostra atingem o plano focal, deixando a imagem bluring/embaçada e reduzindo o contraste. Uma solução para reduzir os borrões é a utilização da microscopia de iluminação estrutura.

6 GUSTAFSSON, M.G.L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy, Vol. 198, Pt 2, May 2000, pp. 82±87.

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11 The basic concept behind the ZEISS ApoTome is the use of an evenly spaced grid in the aperture plane to serve as a mask through which the specimen is illuminated. The grid is inserted into the light path of the microscope and uses the epi-illuminator lens system to project a shadow of the grid lines into sharp focus, superimposed on the specimen, in the objective focal plane. In cases where the specimen is relatively thick (such as occurs a tissue section that is greater than 10 micrometers in size), then superimposed on the focal plane will be a composite blurred image from remote parts of the specimen positioned in planes that are remote with respect to the point of focus. During acquisition, three separate images of the thick specimen are sequentially gathered by shifting the grid projection by one-third between each image capture. The resulting image set contains the sum of contributions from the in-focus plane, which are shadowed by sharply defined stripes, plus blurred planes (not focused) that do not contain the distinct striping pattern from the grid. O conceito básico por trás do ZEISS ApoTome é a utilização de uma grade uniformemente espaçados no plano de abertura para servir como uma máscara através do qual a amostra é iluminada. A grade é inserido no caminho da luz do microscópio e utiliza o sistema de lentes epi- iluminador para projetar uma sombra das linhas de grade em foco, sobreposta a amostra, no plano focal objetiva. Nos casos em que a amostra é relativamente espessa (por exemplo, ocorre um corte de tecido, que é maior do que 10 micrómetros ), então, sobreposto sobre o plano focal será uma imagem desfocada composto a partir de partes mais remotas do espécime posicionados em planos que estão afastados com respeitar o ponto de foco. Durante a aquisição, três imagens separadas dos espécime grossas são reunidos sequencialmente, deslocando a projecção de grade por um terço de cada captação de imagem. O conjunto imagem resultante contém a soma das contribuições do plano de focagem, que são sombreados por faixas bem definidas, além de aviões borradas ( não focalizada ), que não contêm o padrão de listras distinto do grid.

12 The raw image set gathered by the ZEISS ApoTome is treated with a simple algebraic function by the application software to produce a single sharp, crisp derivative image that is free of the blur arising from remote focal planes. The simple sum of these three raw images is identical to the normal widefield image of a thin specimen without the use of a grid. In practice, the grid can be shifted rapidly and precisely (driven by a piezo- electric element), and the calculation is performed very rapidly. The rate-limiting step for optical sectioning using the ApoTome is thus the acquisition of the three images. When compared to capturing images with widefield illumination followed by deconvolution image processing, the composite image resulting from the ApoTome is available immediately instead of after minutes, as required for processing by the deconvolution computation. The total exposure of the specimen is slightly greater using the ApoTome because the grid projection is typically not completely opaque. However, the axial resolution is comparable to that achieved by either confocal or deconvolution techniques.

13 O conjunto de imagens brutas recolhidas pela ZEISS ApoTome é tratada com uma função algébrica simples, o software de aplicação para produzir uma única imagem derivado nítidas e que é livre de o borrão decorrente de aviões remoto focais. A simples soma destes três imagens em bruto é idêntico ao normal de imagem de campo amplo de uma fina amostra sem a utilização de uma grade. Na prática, a grade pode ser deslocado rapidamente e com precisão ( conduzido por um elemento piezo - eléctrico ), e o cálculo é feito muito rapidamente. O passo limitante da velocidade para o corte óptico usando o ApoTome é, assim, a aquisição de três imagens. Quando comparado com a captura de imagens com iluminação widefield seguido de processamento de imagem deconvolução, a imagem composta resultante da ApoTome está disponível imediatamente em vez de depois de minutos, conforme exigido para processamento pela computação deconvolução. A exposição total da amostra é ligeiramente superior utilizando o ApoTome porque a projecção grelha não é normalmente completamente opaca. No entanto, a resolução axial é comparável ao obtido por qualquer das técnicas de desconvolução ou confocal.

14 The goal of structured illumination technology (including the ZEISS ApoTome) is to improve the images of thick specimens using a combination of optical manipulations coupled to computational algorithms. Through a remarkably simple process, the blurring produced by defocus can be converted into an effective tool for separating light in the focal plane from obstructing light produced in remote areas of the specimen that are far removed from focus. Among the numerous advantages of structured illumination is the ability to produce crisp optical sections having a thickness that coincides with the objective resolution. This interactive tutorial explores optical sectioning with the ZEISS ApoTome. O objectivo da tecnologia de iluminação estruturada (incluindo o ZEISS ApoTome) é para melhorar as imagens de espécimes de espessura usando uma combinação de manipulações ópticos acoplados a algoritmos computacionais. Através de um processo extremamente simples, a indefinição produzido pela desfocagem pode ser convertido em uma ferramenta eficaz para a separação de luz no plano focal de obstruir luz produzida em áreas remotas do espécime que estão muito distantes do foco. Entre as numerosas vantagens da iluminação estruturada é a capacidade para produzir secções ópticas nítidas, com uma espessura que coincide com o objectivo resolução. Este tutorial interativo explora seccionamento óptico com a ZEISS ApoTome

15 Even through the image sequences produced by laser scanning confocal microscopy, widefield fluorescence deconvolution, and structured illumination techniques are often referred to as optical sections, they differ significantly from true physical sections in that their top and bottom edges are not sharply defined. In a traditional physical tissue section that has been cut by a knife in a microtome, there is no ambiguity about which region of the specimen contains each point in the image. A specific point in the tissue was either included in a particular section or it was not, but there is no intermediate state. An optical section, however, includes some locations that are faithfully reproduced (in effect, present at their true intensity), and other locations above and below that are reproduced at less than their true intensity (particularly at the edges). There exists no sharp cutoff that demarcates what is included in the optical section and what is excluded. Instead, there is a continuous decrease in the ratio of image to specimen intensity for locations that reside further away from the mid-point of the section. Mesmo através das sequências de imagens produzidas por microscopia confocal a laser, widefield deconvolução de fluorescência, e técnicas de iluminação estruturados são muitas vezes referidos como seções ópticas, eles diferem significativamente dos verdadeiros seções físicas em que suas bordas superior e inferior não são bem definidas. Em uma secção de tecido físico tradicional que foi cortado por uma faca num micrótomo, não há ambiguidade sobre a região da amostra contém cada ponto da imagem. Um ponto específico do tecido ou foi incluído em uma seção especial ou que não era, mas não existe um estado intermediário. Uma secção óptica, no entanto, inclui algumas localidades que estão fielmente reproduzidas ( em efeito, presentes na sua verdadeira intensidade ), e outros locais acima e abaixo que são reproduzidas no menos do que a sua verdadeira intensidade ( particularmente nos cantos ). Não existe nenhum corte afiado que demarca o que está incluído na secção óptica e que é excluído. Em vez disso, há uma diminuição contínua do rácio de imagem para espécime intensidade para locais que residem mais longe do ponto médio da secção.

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19 Resolução é a distancia mínima entre dois pontos para que estes apareçam individualizados. A resolução de um microscópio depende da : R = λ /(2NA) Por causa da difração a resolução de um microscópio

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