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Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola1 Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética –Natureza da radiação eletromagnética.

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1 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola1 Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética –Natureza da radiação eletromagnética –Espectro eletromagnético. –Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. –Interação radiação eletromagnética-matéria. –Luminescência: fluorescência e fosforescência. –Fluorescência: Diagrama de Jablonski. –Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência wide-field 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

2 Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola2 Práticas Microscopia de transmissão Microscopia de fluorescência wide-field Microscopia confocal Bibliografia Lakowicz, J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2 nd Edition Kluver Academic/Plenum Publishers, New York. Lichtman, J.W., Conchello, J-A. Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12): , Conchello, J-A., Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods, 2(12): /

3 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola3 Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética –Natureza da radiação eletromagnética –Espectro eletromagnético. –Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. –Interação radiação eletromagnética-matéria. –Luminescência: fluorescência e fosforescência. –Fluorescência: Diagrama de Jablonski. –Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência wide-field 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

4 Ondas mecânicas em um meio elástico Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola4 Meio: Massa (inércia) Elasticidade

5 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola5 Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Carregam energias elétrica e magnética Propriedades do meio de propagação: Armazenar energia elétrica (capacitância) Armazenar enérgia magnética (indutância) Vácuo Permitividade F/m Permeabilidade H/m

6 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola6 Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Velocidade da onda Frequência (ciclos por s, Hz)

7 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola7 Espectro da radiação eletromagnética

8 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola8 Onda: Refração

9 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola9 Fóton photon is the quantum of the electromagnetic interaction and the basic "unit" of light and all other forms of electromagnetic radiation and is also the force carrier for the electromagnetic force.photonforce carrier

10 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola10 Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética –Natureza da radiação eletromagnética –Espectro eletromagnético. –Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. –Interação radiação eletromagnética-matéria. –Luminescência: fluorescência e fosforescência. –Fluorescência: Diagrama de Jablonski. –Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência wide-field 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

11 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola11 Interação radiação EM-matéria: reflexão

12 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola12 Interação radiação EM-matéria: refração

13 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola13 Interação radiação EM-matéria: difração

14 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola14 Luminescência – Fluorescência e fosforescência

15 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola15

16 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola16 Luminescência – Fluorescência e fosforescência Diagrama de Jablonski

17 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola17 Fluoróforos de interesse em Biologia Fluoresceína Rodamina Quinina Acridina exc 250nm 350nm em =450nm exc =530nm em =556nm exc =490nm em =514nm exc =495nm em =526nm

18 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola18 Fontes de luz: Laser x HBO Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente (fase relativa constante), em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático ) Espectro do He-Ne laser Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation)

19 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola19 Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética –Natureza da radiação eletromagnética –Espectro eletromagnético. –Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. –Interação radiação eletromagnética-matéria. –Luminescência: fluorescência e fosforescência. –Fluorescência: Diagrama de Jablonski. –Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência wide-field 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

20 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola20 Dimensões na Biologia

21 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola21 Microscopia - Objetivas

22 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola22 Abertura numérica e aumento

23 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola23 Resolução

24 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola24 Difração limita a resolução – Airy disks

25 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola25 Resolução e refração do meio

26 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola26 Resolução

27 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola27 Aumento e Resolução

28 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola28 Microscopia de luz refletida

29 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola29 Microscopia de luz transmitida

30 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola30 Iluminaçao – Sistema Köhler

31 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola31 Técnicas especiais: Contraste por Interferência Diferencial DIC

32 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola32 Técnicas especiais: Contraste por Interferência Diferencial DIC

33 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola33 Imagem de Fluorescência em Microscopia Wide Field

34 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola34 Fluorescência

35 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola35 Microscopia de fluorescência wide field

36 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola36 Imagem de Fluorescência em Wide Field Filter Cube

37 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola37 Imagem de Fluorescência

38 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola38 Microscópio de epifluorescência Wide Field UV Filter Cube set # (Exciter Filter: G 365, Beam Splitter: FT 395, Barrier Filter: LP 420). This cube is used to visualize UV- excitable fluors like DAPI. Blue Filter Cube set # (Exciter Filter: BP , Beam Splitter: FT 510, Barrier Filter: BP ). Fluorescein, GFP and Oregon Green can be visualized using this filter set. Green Filter Cube set # (Exciter Filter: BP 546±12, Beam Splitter: FT 580, Barrier Filter: LP 590). Green-excitable fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized using this filter set.

39 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola39 Espectro da HBO

40 Microscopia confocal, 2011A. C. Cassola40 Zeiss Axiovert 100 M

41 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola41 Microscópio Confocal Microscópio de fluorescência a laser com iluminação puntiforme Microscópico de varredura Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da epifluorescência Resolução no eixo Z Resolução temporal reduzida.

42 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola42 Microscópio Confocal: aplicaçoes As que demandam resoluçao espacial XYZ Investigação de colocalização de moléculas que possam ser identificadas por indicadores fluorescentes Análise da interação entre moléculas (FRET) Análise da migraçao de moléculas (FRAP) etc

43 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola43 Microscopia confocal

44 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola44 Princípio da Microscopia confocal

45 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola45

46 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola46 Imagem multiespectral

47 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola47

48 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola48 Resoluções lateral e axial

49 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola49 Resolução e Airy pattern

50 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola50 Compromissos

51 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola51

52 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola52 Aplicações do microscópio confocal

53 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola53

54 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola54 Espectros das FP

55 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola55

56 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola56

57 Microscopia confocal, 2010A. C. Cassola57 Inclusões Análise espectral – META (lambda stack - AOTF) Proteínas fluorescentes (


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