Microscopia Confocal: Teoria e técnica

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1 Microscopia Confocal: Teoria e técnica
1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

2 Práticas Bibliografia Microscopia de transmissão
Microscopia de fluorescência wide-field Microscopia confocal Bibliografia Lakowicz, J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd Edition Kluver Academic/Plenum Publishers, New York. Lichtman, J.W., Conchello, J-A. Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12): , 2005. Conchello, J-A., Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods, 2(12): / Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

3 Microscopia Confocal: Teoria e técnica
1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

4 Ondas mecânicas em um meio elástico
Massa (inércia) Elasticidade Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

5 Energia Radiante – Radiação eletromagnética.
Carregam energias elétrica e magnética Propriedades do meio de propagação: Armazenar energia elétrica (capacitância) Armazenar enérgia magnética (indutância) Vácuo Permitividade e0=8.85*10-12F/m Permeabilidade m0=4p*10-12 H/m Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

6 Energia Radiante – Radiação eletromagnética.
Velocidade da onda Frequência (ciclos por s, Hz) Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

7 Espectro da radiação eletromagnética
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

8 Onda: Refração Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

9 Fóton  photon is the quantum of the electromagnetic interaction and the basic "unit" of light and all other forms of electromagnetic radiation and is also the force carrier for the electromagnetic force. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

10 Microscopia Confocal: Teoria e técnica
1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

11 Interação radiação EM-matéria: reflexão
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

12 Interação radiação EM-matéria: refração
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

13 Interação radiação EM-matéria: difração
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

14 Luminescência – Fluorescência e fosforescência
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

15 Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

16 Luminescência – Fluorescência e fosforescência
Diagrama de Jablonski Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

17 Fluoróforos de interesse em Biologia
Quinina lexc 250nm 350nm lem =450nm Fluoresceína lexc=490nm lem=514nm Rodamina Acridina lexc=495nm lem=526nm lexc=530nm lem=556nm Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

18 Fontes de “luz”: Laser x HBO
Espectro do He-Ne laser Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente (fase relativa constante), em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático) Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

19 Microscopia Confocal: Teoria e técnica
1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

20 Dimensões na Biologia Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

21 Microscopia - Objetivas
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22 Abertura numérica e aumento
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23 Resolução Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

24 Difração limita a resolução – Airy disks
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25 Resolução e refração do meio
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

26 Resolução Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

27 Aumento e Resolução Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

28 Microscopia de luz refletida
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29 Microscopia de luz transmitida
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30 Iluminaçao – Sistema Köhler
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31 Técnicas especiais: Contraste por Interferência Diferencial DIC
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32 Técnicas especiais: Contraste por Interferência Diferencial DIC
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33 Imagem de Fluorescência em Microscopia “Wide Field”
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34 Fluorescência Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

35 Microscopia de fluorescência “wide field”
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36 Imagem de Fluorescência em “Wide Field” “Filter Cube”
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37 Imagem de Fluorescência
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

38 Microscópio de epifluorescência “Wide Field”
UV Filter Cube set # (Exciter Filter: G 365, Beam Splitter: FT 395, Barrier Filter: LP 420). This cube is used to visualize UV-excitable fluors like DAPI. Blue Filter Cube set # (Exciter Filter: BP , Beam Splitter: FT 510, Barrier Filter: BP ). Fluorescein, GFP and Oregon Green can be visualized using this filter set. Green Filter Cube set # (Exciter Filter: BP 546±12, Beam Splitter: FT 580, Barrier Filter: LP 590). Green-excitable fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized using this filter set. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

39 Espectro da HBO Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

40 Zeiss Axiovert 100 M Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola

41 Microscópio Confocal Microscópio de fluorescência a laser com iluminação puntiforme Microscópico de varredura Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da epifluorescência Resolução no eixo Z Resolução temporal reduzida. Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

42 Microscópio Confocal: aplicaçoes
As que demandam resoluçao espacial XYZ Investigação de colocalização de moléculas que possam ser identificadas por indicadores fluorescentes Análise da interação entre moléculas (FRET) Análise da migraçao de moléculas (FRAP) etc Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

43 Microscopia confocal Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

44 Princípio da Microscopia confocal
A. C. Cassola

45 Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

46 Imagem multiespectral
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

47 Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

48 Resoluções lateral e axial
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

49 Resolução e “Airy pattern”
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

50 Compromissos Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

51 Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

52 Aplicações do microscópio confocal
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

53 Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

54 Espectros das FP Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

55 Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

56 Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola

57 Inclusões Análise espectral – META (lambda stack - AOTF)
Proteínas fluorescentes ( Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola