BACTERIÓFAGOS.

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1 BACTERIÓFAGOS

2 Descobrimento Descobrimento
Em 1896, o bacteriologista e naturalista inglês Ernest Hanbury Hankin (1865 –1939) que viveu muitos anos na India, relatou que algum agente presente nas águas do Rio Ganges e Yamuna possuía ação antibacteriana contra o Vibrião da Cólera e que esse agente era filrável em filtros de porcelana.

3 Descobrimento Superintendente do “Brown Institution of London”, relatou o descobrimento de um pequeno agente que infectava e matava bactérias. Inferiu que podia ser: 1) Um estágio no ciclo de vida das bactérias; 2) uma enzima que a bactéria produzia; ou 3) um vírus que crescia e destruía a bactéria. Pesquisador do Instituto Pasteur de Paris anunciou em 3 de setembro de 1917 que havia descoberto um “agente invisível “ antagonista dos micróbios causadores de diarréias e os denominou bacteriófagos ou “comedores de bactérias”

4 Conceitos Básicos  São vírus DNA ou RNA que parasitam apenas organismos procariontes.  Os mais conhecidos são os que invadem a bactéria intestinal Escherichia coli, conhecidos como fagos “T” .

5 Constituição Básica São constituídos por uma cápsula protéica que apresenta uma região denominada cabeça. Em geral tem formato poligonal, envolvendo o material genético e uma região denominada cauda com formato cilíndrico, contendo, em sua extremidade livre, fibras protéicas.

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7 Envelopados Não envelopados Modelos de Fagos

8 BACTERIÓFAGOS DE IMPORTÂNCIA BIOTECNOLÓGICA E USADOS NO
MONITORAMENTO AMBIENTAL Grupo Família Genoma Estrutura Bacteriófago A Myoviridae ds DNA Cauda contrátil T2, T4, T6 B Siphoviridae Cauda longa, não contrátil λ (lambda), T5 C Podoviridae Cauda curta, não contrátil T7, T3 D Microviridae ssDNA Sem cauda, cabeça grande ѲX174, S13 E Leviviridae Sem cauda, cabeça pequena Grupo 1: MS-2, f2, R-17, JP501 20–30 Grupo 2: GA, DS, TH1, BZ13, KU1, JP34 Grupo 3: Qb, VK, ST, TW18 Grupo 4: SP, FI, TW19, TW28, MX1, ID2 F Inoviridae Sem cabeça, cauda flexível SJ2, fd, AE2, M13 Bradley 1967; Tomoeda et al. 1975; Furuse, et al. 1979; Sobsey et al

9 Genomas de Fagos Genoma de DNA ou RNA Fita dupla (ds) ou fita simples (ss) Circular ou linear Geralmente não segmentado  Nenhum descoberto até o momento usa RT Morfologia varia de simples icosaédricos a filamentosos A maioria dos fagos têm “cauda” (“tailing”)

10 Genomas de Fagos 1) Genomas RNA (pequenos e ss – menor que 10 Kb)
2) Genomas DNA (pequenos - menor que 10Kb) 3) Genomas DNA médios e grandes (30 a 200kb): 4 grupos com morfologias similares e que podem produzir recombinantes viáveis: Exemplos: 1) Bacteriófago T1 (~50 kb) 2) Bacteriófagos T2, T4, e T6 (~170 kb) 3) Bacteriófagos T3 e T7 (~40 kb) 4) Bacteriófago T5 (~130 kb)

11 Fields, Virology 5th ed

12 Biossíntese viral de fagos com cauda e cabeça e genoma dsDNA (“T”)
Fields, Virology 5th ed

13 Denominamos como profagos.
Ciclos de Replicação Têm dois tipos de ciclo : Lítico e Lisogênico Durante o ciclo lisogênico as funções líticas ficam reprimidas e o genoma do fago normalmente fica integrado no genoma da bactéria. Denominamos como profagos. Ex: Fago Lambda

14 Bacteriófagos: Ciclo Lítico ou Lisogênico
E. coli genome Injeção do DNA linear do fagoλ Bacteriófagos: Ciclo Lítico ou Lisogênico Phage λ cos sites DNA linear do fago λ (50,000 bp) cos sites União das extremidades cos DNA circular do fago λ Genoma da E.coli Recombinação do DNA do DNA do fago λ e DNA da E. coli LISOGENIA Progenie do fago λ com o gene da bactéria Indução da replicação do fago LÍTICO Encapsulação do fago

15 Ciclo Lítico Fase inicial - Proteínas necessárias para replicar DNA
- Proteínas reguladoras - Normalmente alteram proteínas da célula hospedeira Fase tardia - Replica DNA - Proteínas da estrutura viral

16 Fagos Virulentos Subvertem o sistema do hospedeiro que passa por uma fase lítica que culmina no rompimento (lise) da célula hospedeira para liberar os vírions

17 Fagos Cronicamente Infectantes
Em casos raros fagos como o ssDNA M13 ficam continuamente liberando virions sem rompimentos da célula hospedeira.

18 Fatores de Virulência Carreados por Fagos
Fagos podem carregar consigo fatores de virulência: CAUSAR RECOMBINAÇÕES...

19 Transdução Transferência de Genes Bacterianos por Fagos

20 Transferência de Genes Bacterianos por Fagos

21 Aplicações Biotecnológicas - Fagos

22 Aplicações Biotecnológicas - Fagos
De 1970 até o ano 2000, os bacteriófagos emergiram como ferramentas importantes na clonagem de genes com inúmeras aplicações. Atualmente estão novamente ganhando importância não só como modelos na biologia molecular e celular, mas também em questões de genômica evolucionária, ecologia e patogênese bacteriana.

23 Aplicações mais usuais...
Aplicações Biotecnológicas - Fagos Enzimas úteis em Manipulação Gênica - Vetores (fagos ou cosmídeos) Phage display Terapias - Fagoterapias Aplicações mais usuais...

24 Polimerização dos Ácidos Nucleicos
Ligações fosfodiéster constituem o núcleo principal da vida já que são parte da constituição básica de todos os ácidos nucleicos. A hidrólise das ligações fosfodiester são catalisadas pelas fosfodiesterases (quebra do DNA)

25 Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância Biotecnólogica
DNA Polimerase T4 Atividade de exonuclease 3’ 5’ e de polimerase ’  3’; Não apresenta atividade de exonuclease 5’ 3’; Pode ser utilizada na finalização da extremidade 5’ saliente e marcação do terminal 3’ da fita dupla de DNA; Atividade de exonuclease: retira aproximadamente 40 bases/minuto na fita dupla e 4000 bases da fita simples; Atividade de endonuclease: polimeriza nucleotídeos/minutos em condições padronizadas.

26 DNA Polimerase do bacteriófago T7

27 Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância Biotecnólogica
T7 DNA Polimerase - BACTERIÓFAGO T7 A T7 DNA polimerase tem uma velocidade de incorporação de nucleotídeos de 300 nucleotídeos por segundo. Essa enzima é usada na preparação de sondas moleculares radioativas e na amplificação gênica (PCR) de grandes fragmentos de DNA. A mutagênese in vitro da T7 DNA polimerase resulta na eliminação completa da atividade exonucleolítica da enzima, aumentando assim sua velocidade de adição de nucleotídeos (polimerização do DNA) em 9X.

28 RNA polimerases Principais usadas em Biologia Molecular: SP6 e T7- RNA polimerase SP6 - Bacteriófago da Salmonella typhymurium LT2 Transcrição! Bacteriófago T7

29 RNA Polimerases dos Fagos SP6 e T7
Bacteriófago SP6 (infecta Salmonella typhimurium) produz RNA polimerase SP6 e o bacteriófago T7 produz a RNA polimerase T7. São RNA polimerases DNA dependentes e catalisam a elongação 5’3’ de cópias de RNA a partir do DNA molde (transcrição). Ambas são similares e são usadas para sintetizar o RNA a partir de DNA dupla fita molde. SP6 e T7 RNA polimerases são extremamente promotores específicas e irão transcrever RNA a partir de qualquer sequência de DNA que foi clonada adjacente a um promotor.

30 Modelo deve ser linearizado
RNA polimerases  Usadas para: Síntese in vitro de transcritos anti-senso; Produção de RNAs marcados com sondas; Mapeamento com proteção de RNase (expressão de RNAm). SP6 e T7 – RNA polimerase Mg2+ e DNA molde fita dupla; Espermidina e albumina de soro; Transcritos downstream ao promotor; Transcreve até a cauda poli-A. Modelo deve ser linearizado

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32 Ligases utilizadas em biologia molecular
Cofatores

33 DNA ligases Mais usada em Biologia Molecular:
Bacteriófago T7 Vírus da Chlorella Bacteriófago T4 Mais usada em Biologia Molecular: T4 DNA ligase – Requer Mg2+ e ATP como cofatores; Repara fitas simples em DNA dupla fita, RNA ou híbridos de DNA/RNA.

34 Atividades das DNA ligases
Conectam fragmentos de DNA por Ligações fosfodiéster 3’ OH – 5’PO4- 1° AMP 2° União 3°liberação AMP

35 Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância Biotecnólogica
DNA Ligases - BACTERIÓFAGO T4 DNA ligases conectam fragmentos de DNA catalisando a formação de ligações fosfodiéster entre o terminal 3’OH e o terminal 5’ fosfato. São usadas em Biologia Molecular para ligar fragmentos de DNA com extremidades coesivas ou extremidades cegas, como os gerados por clivagem por enzimas de restrição; Servem ainda para adicionar “adaptadores” sintéticos ou reparar quebras no DNA; A DNA ligase mais frequentemente utilizada em Biologia Molecular é a isolada do bacteriófago T4.

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37 RNA ligases T4 RNA ligase
Ligações fosfodiéster (5’PO4 – 3’OH) em fitas simples de DNA ou RNA. T4 RNA ligase T4 RNA ligase 1 – RNA fita simples.

38 T4 RNA ligase 1: A RNA ligase mais bem caracterizada e mais utilizada em Biologia Molecular
Aplicações: Análise da estrutura do RNA; Mapeamento de sítios de ligação de proteínas; Rápida amplificação de extremidades de DNAc; Ligação de oligonuceotídeos adaptadores no DNAc; Síntese de oligonucleotídeos; Modificação de ácidos nucléicos na região 5’; Extensão de iniciadores na PCR; Usada na circularização de moléculas de RNA e DNA.

39 T4 RNA ligase 2 Catalisa ligações intramoleculares e intermoleculares em RNA; Mais ativas para ligações de RNA; Também pode ligar DNA dupla fita.

40 T4 Polinucleotídeo quinase

41 T4 Polinucleotídeo quinase
Descoberta em E. coli infectadas por T4 As bactérias infectadas quebram sítios específicos de seus tRNAs para interferir na manutenção viral (desfosforilação) O T4, por sua vez, utiliza sua quinase para restaurar esses tRNAs

42 Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância Biotecnólogica
Polinucleotídeo quinases - BACTERIÓFAGO T4 Catalisam a transferência de grupos fosfatos para o terminal 5’-OH dos ácidos nucleicos (DNA ou RNA) Utilidades: Quando o ATP está marcado radioativamente (ex:  32P-ATP), a polinucleotídeo quinase gera DNA ou RNA marcado com 32P no terminal 5’ catalisando a fosforilação direta dos grupos 5’-OH.

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44 BACTERIÓFAGOS COMO VETORES DE CLONAGEM GÊNICA

45 BACTERIÓFAGOS COMO VETORES DE CLONAGEM GÊNICA
A ideia de ligar segmentos de DNA através das extremidades coesivas do bacteriófago tornou-se o “curinga” dos experimentos de engenharia genética. Com o reconhecimento das enzimas de restrição e das outras ferramentas de clonagem, os sítios coesivos se tornaram o local ideal de ligação dos DNAs exógenos. VETORES DE CLONAGEM

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48 Bacteriófago Lambda (λ)
Em 1962 (Allan Campbell)  Observou que o genoma linear do bacteriófago λ formava um círculo quando entrava na bactéria hospedeira e um evento de recombinação ocorria com a iDNA do fago Lambda  Análises posteriores revelaram que o fago λ possui regiões pequenas de DNA simples fita cuja sequência é complementar ao outro lado da sequência linear. Essas regiões foram denominadas sítios cos (coesivos) e isso permite que o DNA linear fique circular quando entra na bactéria hospedeira

49 Bacteriófago Lambda (λ)
Digerido pela enzima de restrição PstI  Usado comumente em Biologia Molecular ¨ Como marcador molecular ¨ Na inserção do DNA do fago no cromossomo da bactéria.

50 Kary B. Mullis, Scientific American (1990) 262:36.

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54 Bacteriófagos como Marcadores na Contaminação Aquática

55 Bacteriófagos como Marcadores na Contaminação Aquática
Alguns bacteriófagos são aptos para infectar bactérias da microbiota normal do trato gastrointestinal humano e assim podem ser encontradas no esgoto e águas residuais. VANTAGENS DO USO DE FAGOS COMO INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA POR ESGOTO Especificidade: Ocorrem consistentemente e exclusivamente em fezes humanas e no esgoto, não se replicando no ambiente; Sensibilidade: Estão presentes em maiores quantidades do que os vírus entéricos além de serem mais estáveis aos tratamentos de águas. 2000 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 88, 5–21

56 BACTERIÓFAGOS JÁ PROPOSTOS COMO INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA
Colifagos somáticos: (Kott 1966; Hilton and Stotzky 1973; Kott et al. 1974; Iawprc 1991), Colifagos de genoma RNA (FRNA phages) : (Havelaar and Hogeboom 1984; Iawprc 1991) Fagos que infectam a bactéria Bacteroides fragilis (Armon and Kott et al.1993; Jofre et al. 1986; Tartera and Jofre 1987; Iawprc 1991; Grabow et al. 1995; Gantzer et al. 1998a).

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58 Obrigada!