PRODUÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS P. chrysogenum P. notatum A. niger A. oryzae Monascus purpurea.

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1 PRODUÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS P. chrysogenum P. notatum A. niger A. oryzae Monascus purpurea

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3 AÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS SOBRE BACTÉRIAS antraciclinas polienosbeta-lactâmicos bleomicinas estreptomicina cloranfenicol eritromicina tetraciclinas rifamicinas

4 AÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS SOBRE FUNGOS Síntese de parede celular: Polioxinas inibem a síntese de quitina Azóis e alilaminas inibem a síntese do ergosterol Griseofulvina impede a agregação de microtúbulos durante a mitose Os polienos se ligam ao ergosterol comprometendo a integridade da membrana 5-Fluorocitosina é um análogo de nucleotídeo que inibe a síntese de ácidos nucleicos

5 ANTIBIÓTICOS- Produtos de metabolismo secundário - Não são produzidos durante o estágio de crescimento microbiano. - Contraindicada a fermentação contínua. - Sujeito a flutuações de rendimento. ln número de células tempo Ótimo de produção (pode ser esticado)

6 Índice terapêutico

7 PRODUTORES DE ANTIBIÓTICOS -Microrganismos do solo que sofrem processo de esporulação - Streptomyces - Bacillus - Mixobactérias - Fungos - Esporulação requer transcrição diferenciada de vários gens. - Transcrição depende de subunidade sigma da RNA polimerase (que faz parte da região de reconhecimento do DNA). - Streptomyces possui ao menos sete diferentes. - Embora não tenha sido provado acredita-se que os mecanismos são similares.

8 PRODUTORES DE ANTIBIÓTICOS - Excesso de fonte de carbono inibe a síntese de antibióticos. (principalmente de açucares facilmente metabolizáveis). - Resposta à competição por parte de outros microrganismos Produção de antibióticos. Ideal – mutantes que não sofrem repressão por catabólito. - Nitrogênio e fosfato também inibem produção (solo kanuma-tsushi no Japão – Bonzai)

9 PRODUTORES DE ANTIBIÓTICOS - Antibióticos produzem retroalimentação negativa. (microrganismos superprodutores necessitam mais antibióticos adicionados ao meio para haver a mesma inibição). - Solução – promover a excreção de antibióticos, usando polienos que alteram a permeabilidade da membrana. -Problema – recuperação do antibiótico. -Algumas eubactérias são vítimas do próprio antibiótico produzido, razão pela qual desenvolvem mecanismos de excreção e/ou genes de resistência. Frequentemente estes gens estão em cluster com os de produção

10 EFEITOS EM PRECURSORES

11 Condições de Fermentação Esporulação 1 a Ferm.2 a Ferm.3 a Ferm. Reprodução vegetativa – com eventual perda de propriedades Em Streptomyces os gens de produção estão localizados em braços terminais de cromossomos lineares e é frequente a deleção completa de todo o cluster.

12 Condições de Fermentação - Organismos cultivados submersos com suprimento generoso de oxigênio e nutrientes. - Ao chegar à fase estacionária (onde há produção de antibiótico) o aporte de carbono, nitrogênio e fosfato é cuidadosamente controlado. - Para a penicilina G cerca de 10% do carbono adicionado é transformado no antibiótico (até ~ 30g.L -1 )

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14 Recuperação do antibiótico do meio - Extração em solvente orgânico e posterior ocristalização - Coluna trocadora de íons - Precipitação química - Adsorção

15 Tanques Cristalizadores Depois da fermentação o micélio é separado e a fase líquida sofre adição de butanol nos tanques. Ao evaporar ele arrasta a água consigo, resultando em uma pasta de penicilina com cerca de 99% de pureza

16 Método Tradicional S – mutação espontânea X – raio-X UV e NM – nitrogen mustard Segue-se o screening ou a seleção Melhoramento Genético

17 Screening – ensaio um a uma para se evidenciar a produção de metabólito. Laborioso e demorado. Seleção – encontra-se um meio em que somente o produtor de determinado metabólito cresça em cultivo. Ex. como as penicilinas e as tetraciclinas são quelantes de metais pesados, a resistência à adição crescente dos ditos no meio de cultivo é medida da capacidade de produção dos antibióticos.

18 Métodos Genéticos Clássicos - Em Penicillium muitas cepas mutantes perdem muito de sua capacidade vital: crescem lentamente e/ou são susceptíveis a condições adversas. - Embora não possuam ciclo sexual verdadeiro, o ciclo parasexual chega a formar heterocarions. Solução – retrocruzamento com cepa selvagem.

19 Clusters de genes em Streptomyces Como eles possuem DNA conjugacional é possível o rearranjo para a formação de progênie mais efetiva. Frequentemente ocorrem deleções que chegam a comprometer toda a capacidade produtora de uma cepa. Existem fragmentos de DNA linear com seqüências teloméricas.

20 Fusão de Protoplastos Tratamento com lisina Células vegetativas Adição de polietilenoglicol protoplastos (sem parede) Protoplasto com duplo material nuclear Fusão do material nuclear Restauração da parede celular Deleção do material genético redundante Nova célula vegetativa recombinada

21 Streptomyces coelicolor – modelo S. avermitilis - produtor da avermectin (antiparasítica) Genoma de 9 milhões de pares de base (E.coli – 4,7 mi) 60 a 65 de fatores sigma (constituinte da RNA polimerase reconhecedores de promotores genéticos). Perto de 800 proteínas secretadas. Pela clonagem o P. chrysogenum pode ter 50 clusters produtores de antibióticos. Muito antibióticos são produzidos pela vias poliquetídeo e isoprenóide, as sínteses peptídicas não ribossomais.

22 Antibióticos polipeptídicos com síntese não ribossomal

23 Acil carrier protein Acil transferase  -cetoacil ACP sintase e  -cetoacil ACP redutase (exceto módulo 3) Síntese da eritromicina no Saccharopolispora erythrea (open reading frames)

24 Inserção genética

25 Transformação da ANTIBIÓTICOS Uma vez obtido o ácido penilinânico ele serve de ponto de partida para a síntese de outros  -lactâmicos semi- sintéticos.

26 Estratégia Microbiológica de Transformação Linhagens auxotróficas

27 EXEMPLOS DE VARIANTES

28 Resistência

29 Mecanismos - Inativação enzimática (Ex:  -lactamases) - Mutação da proteína alvo - Transferência genética - Mecanismos de não transferência intracelular e/ou ativação de mecanismos bombeadores.

30 Resistência cruzada: Determinado antibiótico propicia a resistência de outro Tilosina eritromicina

31 Um dos maiores fatores de resistência é o uso indiscriminado em agropecuária, onde sub- doses são usadas para prevenir enterites no gado, diminuindo o tempo para abate Alguns países Europeus proíbem o uso Proibição é driblada por prescrições veterinárias Resistência à tetraciclina não diminuiu

32 Acredita-se que 84 % dos antimicrobianos sejam usados na agopecuária. Usa-se antibióticos para controlar o crescimento de Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc e Weissella. (3 a 5% de perda) Embora tenha-se propalado que o processo enzimático inativa os antibióticos usados na indústria alcooleira, a análise do extrato seco (posteriormente usado como ração animal) confirmou a presença de vários antibióticos (eritromicina, virginiomicina, tilosina)

33 Resistência Não suscetibilidade Evolução dos casos de não suscetibilidade entre Streptococcus pneumoniae na Ingletarra e no país de Gales.

34 Resistência à Ciprofloxacina

35 Nos EEUU, os antibióticos mais comumente usados são a penicilina, a estreptomicina e as tetraciclinas Estes são os antibióticos que possuem casos mais numerosos de resitência

36 Plasmídeos isolados antes de 1983 apresentavam apenas um gen de resistência codificando uma enzima modificadora dos aminoglicosídeos Hoje estes plasmídeos apresentam inúmeros gens de resistência que podem ser repassados em cadeia.

37 MRSA – Methicillin Resistant S. aureus maior causador de casos de infecções hospitalares. A vancomicina foi então ressuscitada pois não se encontrava resistência a ela entre MRSA; Atualmente já existem cepas resistentes, embora raras, por transferência horizontal de gens do Enterococcus

38 DRIBLES NA RESISTÊNCIA KAMIKASE Amplo espectro (gram negativas e positivas) resiste ao ataque de lactamases