Histologia e seus métodos de estudo

Apresentação em tema: "Histologia e seus métodos de estudo"— Transcrição da apresentação:

1 Histologia e seus métodos de estudo
Rosiane Nascimento Alves

2 Histologia Tecidos do corpo órgãos 4 tipos de tecidos fundamentais:
Tec. Epitelial Tec. Conjuntivo Tec. Muscular Tec. Nervoso

3 Tecidos Constituição: Cada tecido: Células + matriz extracelular (MEC)
Células + MEC característicos Distinção no reconhecimento

4 Preparação de tecido para microscopia
Método mais utilizado MO Feixe de luz atravessa a estrutura Tecidos e órgãos são espessos Fixação da amostra, inclusão em parafina, corte histológico, coloração.

5 Preparação de tecido para microscopia
Fixação Evitar autólise e preservar estrutura e composição Física (congelamento) ou química (formaldeído 4%) Inclusão Desidratação em etanol e clareamento em xilol Inclusão em parafina

6 Bateria de inclusão Blocos de parafina

7 Preparação de tecido para microscopia
Microtomia Cortes de 4µm de espessura em lâmina de vidro 1µm = 0,001mm

8 Coloração Evidenciar os vários componentes dos tecidos, células e MEC
Corantes: caráter ácido ou básico que formam ligações eletrostáticas (salinas) com componentes ionizados dos tecidos Básico Básico Núcleo é ácido pela presença dos ácidos nucléicos. Glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas tb são. As mitocôndrias, grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno são básicos. Ácido

9 Hematoxilina e Eosina (HE)
Hematoxilina: corante básico (azul ou violeta) Liga-se à estruturas basófilas (núcleo) Eosina: corante ácido (rosa) Liga-se à estruturas acidófilos (citoplasma) Células intestinas de camundongos

10 Hematoxilina e Eosina (HE)
Aplicações: Caracterização do tecido Identificação de carcinoma Identificação de infiltrado inflamatório → PATOLOGIA Células renais humanas Células renais de carcinoma humano

11 Hematoxilina e Eosina (HE)
Infiltrado Inflamatório Células hepáticas de camundongo

12 Hematoxilina e Eosina (HE)
Necrose Células hepáticas de camundongo Fibrose deposição progressiva de fibronectina laminina e colágeno no interstício com consequente expansão e distensão da matriz extracelular Necrose morte celular ocorrida no indivíduo vivo seguido de autólise (degradação enzimática pelas enzimas lisossomais da própria celula)

13 Microscópio de luz

14 Resolução Imagem aumentada e com detalhes Limite de resolução:
A menor distância entre 2 partículas que permite visualizá-las como 2 objetos separados. MO: 0,2µm (0,002mm) MET: 3nm (0,003µm ou 0,00003mm)

15 Outras microscopias Contraste de fase
Células e cortes não corados (transparentes) Microscopia convencional Contraste de fase Contraste diferencial

16 Reação de Imunohistoquímica (IH)
Detecção da reação química: Anti-Leishmania + enzima Substrato da enzima PRECIPITADO MARROM Figura 3. Reação de imunohistoquímica mostrando formas amastigotas de Leishmania extracelulares (A) e intracelulares (B) em esfregaço de aspirado de linfonodo poplíteo de cão naturalmente acometido por leishmaniose visceral. Bloqueio com molico - caseína Infecção por Leishmania sp. Amastigotas extracelulares (A) e intracelulares (B).

17 Reação de Imunofluorescência (IF)
Baseada na excitação de átomos de fluorocromo 1. Emissão de luz (fotons) com pequeno  (comprimento de onda). 2. Excitação de elétrons, os quais saltam de camada. 3. Estes retornam à sua camada original. 4. Liberação de luz (fotons) em um maior comprimento de onda (visível). 5. Visualização com microscópio de fluorescência. (confocal) UV (Não visível) Espectro visível

18 Microscopia de Fluorescência (MF)
Laranja Marcador anti- L. monocitogenes Verde Filamentos de actina Amarelo Sobreposição das duas marcações: Laranja e verde Infecção por Listeria monocitogenes

19 Microscopia Confocal O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito A imagem coletada deve passar por um orifício muito pequeno Focalizar um único plano de cada vez sem deterioração da imagem Luz fora do foco é eliminada Definição melhorada do objeto Localização mais precisa de componentes do espécime 1. A iluminação é frequentemente provida por uma fonte de laser, 2. como esta fornece um ponto de iluminação mto pequeno, ele deve ser varrido sobre o especime para permitir a observação de uma area maior do especime, 3. o componente do espécime que é de interesse deve ser marcado com uma molecula fluorescente, 4. a luz usada para formar a imagem é aquela que é refletida pelo espécime, 5. a luz refletida é capturada por um detector , onde o sinal é amplificado eletronicamente para ser visto em um monitor. Reunir os vários planos = objeto 3D

20 Microscopia Confocal Azul DNA Verde Fimamentos intermediários Vermelho
Filamentos de actina Cultura de plasmócitos

21 Microscopia Confocal Fases do ciclo celular
Em vermelho DNA, em azul microtúbulos indicando o citoplasma. A intérfase. B prófase. C metáfase. D anáfase. E telófase inicial. F telófase adiantada. (pag 60 Junqueira) Fases do ciclo celular

22 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Elétrons são liberados pelo aquecimento de um delicado filamento metálico (chamado catodo, geralmente de tungstênio) em vácuo. Os elétrons libertados no catodo são submetidos a uma diferença de voltagem de KV existente entre o catodo e o anodo, que é um prato metálico com um orifício em seu centro. Desta maneira, os elétrons são atraídos pelo anodo e acelerados, atingindo altas velocidades. Após passarem pelo orifício do anodo eles formam um feixe de elétronsque percorre o tubo do microscópio. No tubo, o feixe de elétrons passa pelo interior de bobinas elétricas e é desviado de maneira análoga ao que acontece com um feixe luminoso em lentes de vidro. Por esta razão, as bobinas dos microscópios eletrônicos são chamadas de lentes eletromagnéticas. Ao atravessar o corte alguns elétrons interagem com átomos do espécime e continuam seus trajetos em direção às outras lentes, enquanto outros elétrons simplesmente cruzam o corte sem interagir com ele. Nossa retina não é sensível a elétrons, para se observar uma imagem os elétrons necessitam ser captados por um detector – uma placa fluorescente, um negativo fotográfico ou uma câmera CCD. Como a imagem no MET é produzida pelo balanço da qtdade de elétrons que atingiram o detector e elétrons que foram retidos no tubo do microscópio, a imagem resultante é sempre em preto e branco Utiliza corte mto mais delgados (40 – 90 nm), feitos de material incluido em resina de plastico (epóxi) e cortados com navalhas de vidro ou diamante em um ultra-micrótomo.

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24 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Cardiomiócitos de Tilápia tailandesa

25 Microscopia Eletrônica de Transmissão

26 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Marcação citoquímica para detecção enzimática: Incubação em meio Gormori -glicerofosfato + Pb(NO3)2 → ↓Pb(PO4) Fosfatase ácida Célula renal de rato

27 Microscopia Eletrônica de Transmissão
CE L

28 Microscopia Eletrônica de Varredura
Imagens pseudotridimensionais das superfícies de células, tecidos e órgãos Os elétrons não atravessam o espécime Os elétrons varrem uma delgada camada de metal aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal Neste microscópio um feixe de elétrons de diâmetro mto pequeno é focalizado sobre o espécime percorrendo sequencialmente (varrendo) sua superfície

29 Microscopia Eletrônica de Varredura
Eritrócitos humanos

30 Microscopia Eletrônica de Varredura
Mucosa respiratória de rato Superfície coberta por cílios; C, células calciforme.