Análise de aberrações cromossômicas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae expostas a radiação  Juan Lucas Argueso - Tom Petes’ Lab Department of Molecular.

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1 Análise de aberrações cromossômicas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae expostas a radiação  Juan Lucas Argueso - Tom Petes’ Lab Department of Molecular Genetics & Microbiology Duke University Medical Center Durham, North Carolina, EUA. Pesquisa desenvolvida em colaboração com Jim Westmoreland e Mike Resnick Chromosome Stability Section National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Research Triangle Park, North Carolina, EUA.

2 Roteiro do seminário: - Introdução: danos ao DNA através de radiação ionizante; mecanismos de reparo de quebras de fita dupla (DSBs); consequências de erros no reparo: aberrações cromossômicas. - Descrição do projeto atual: formação de quebras através de radiação  e; caracterização de aberrações cromossômicas em S. cerevisiae. - Planos para o futuro: caracterização do “hotspot” no cromossomo 5; estabilidade genômica durante processos fermentativos; regulação e reparo de quebras durante a recombinação meiótica.

3 Estudos pioneiros relacionando radiação ionizante a danos no material genético: Em 1927, Hermann Muller demostrou em Drosophila melanogaster que agentes externos (raios X) podem causar mutações. Em 1931, Barbara McClintock foi a primeira a associar alterações cromossômicas a fenótipos específicos em milho, inaugurando a visão de que a mutagênese também pode ter base citogenética. Fonte: Preston (2005) Health Physics 88:545

4 Danos a bases e nucleotídeos Dímeros Quebra de fita simples “nick” Quebra de fita dupla “DSB” Tipos de dano causados ao DNA por radiação ionizante Proporção aproximada = 60 bases danificadas : 30 nicks : 1 DSB Quebra de fita dupla “DSB” “Crosslinks”

5 Vias alternativas para o reparo de quebras de fita dupla: União de terminações (NHEJ) Recombinação homóloga (DSBR)

6 Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais: Translocações 2 / 8 Cromossômo Filadélfia: Translocação 9/22 presente em casos de leucemia.

7 Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais: Translocações, Deleções, Amplificações, etc... Stratakis et al. (2000) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 86:3396 Anisomastia: Amplificação no braço longo do cromossômo 16

8 Detecção de aberrações cromossômicas geradas através de quebras de dupla fita no DNA em células diplóides 80 krads 3. Irradiação com 137 Cs 30% sobrevivência 4. Plaqueamento e obtenção de colônias sobreviventes 1. Cultura de células diplóides em crescimento exponencial 2. Sincronização do ciclo celular no estágio G2 (Nocodazole) Nocodazole G2 (4n DNA) Análise de aberrações 5. Identificação e análise de aberrações cromossômicas

9 krads 0 5 10 20 40 60 80 Formação de quebras de dupla fita em células diplóides sincronizadas em G2  cr2 810 kb cr4 1530 kb cr1 250 kb cr4 5.1 quebras/Mb/80 krad cr2 5.0 quebras/Mb/80 krad cr1 5.7 quebras/Mb/80 krad krads 0 5 10 20 30 40 60 80

10 Restauração de cromossomos após 80 krads de radiação  (~250 DSBs por célula) cr2 810 kb cr4 1530 kb cr1 250 kb Tempo (horas) 0 0 0.5 1 1.5 2 3 4 cr4 cr2 cr1 (hours) 0 0 0.5 1 1.5 2 3 4

11 Colônias individuais sobreviventes apresentam numerosas aberrações cromossômicas após exposição a 80 krads de radiação  12 4 7+15 16+13 2 14 10 11 5+8 9 3 1+6 cr 75% contém pelo menos uma nova banda cromossômica Segunda fase: Análise qualitativa das aberrações cromossômicas induzidas por radiação  Microarranjos genômicos - Hibridação Genômica Comparada (Comparative Genomic Hybridization - CGH)

12 Representação esquemática da análise por CGH Purificação e fragmentação de DNA genômico da linhagem original Purificação e fragmentação de DNA genômico da colônia sobrevivente Incorporação de Cy3 (fluorescência verde) Incorporação de Cy5 (fluorescência vermelha) Mistura e hibridação no microarranjo Amarelo = razão 1:1 Verde = Deleções Vermelho = Amplificações Detecção de alterações de dosagem gênica 13,000 sondas cobertura completa do genôma de S. cerevisiae

13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Exemplo de uma análise CGH Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8. JW8 Amplificação interna no cromossomo 5 entre dois elementos Ty e suas LTRs (  )  Ty1 

14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 JW8  Amplificação terminal no braço esquerdo do cromossomo 7 a partir de um grupo de LTRs (  e  ) Exemplo de uma análise CGH Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.

15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 JW8  Ty1  Deleção termimal no braço direito do cromossomo 13 a partir de um Ty1 e suas LTRs Exemplo de uma análise CGH Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.

16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 JW8 Deleção terminal no braço esquerdo do cromossomo 5 a partir do gene HXT13 HXT13 Exemplo de uma análise CGH Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.

17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 JW8 Amplificação terminal no braço esquerdo do cromossomo 4 a partir do gene HXT15 HXT15 Exemplo de uma análise CGH Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.

18 Elementos retrotransponíveis Ty no genoma de Saccharomyces cerevisiae Kim et al. (1998) Genome Research 8:464 Inserções completas Inserções ancestrais 32217 1334 241 332 17

19 Distribuição de aberrações cromossômicas e pontos de resolução (Breakpoints) detectados através de CGH em 37 colônias sobreviventes. Aberrações numéricas (aneuploidias): (cr1, cr1, cr6 e cr6)4 Monossomias (cr1, cr1, cr5, cr8, cr9, cr9, cr11, cr12, cr13)9 Trissomias (34.8%)32 Ty ancestrais (LTRs) (6.5%) (7.6%) 6767 outros sítios homeólogos sítios heterólogos (51.1%)47 Ty completos “Breakpoints” posicionados em: (6.7%)5 Amplificações internas (17.6%)13 Deleções internas (39.2%)29 Amplificações terminais (36.5%)27 Deleções terminais Aberrações estruturais: 40 deleções : 34 amplificações 86% em Ty’s ou LTRs 92% em sítios homeólogos

20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 JW8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 RefJW8 12 4 7+15 16+13 2 14 10 11 5+8 9 3 1+6 Translocação não-recíproca do cr7 para o cr13 (~460Kb) Análise de aberrações cromossômicas específicas e modelos moleculares para o reparo das quebras no DNA.

21 Análise da translocação of cr7 - cr13 em JW8 por PCR: 7L POX1  KEX1 13L NUP116  IOC4  Ty1 JAO125JAO126 JAO124JAO123 Ref JW8 125+126 Ref JW8 124+123 Ref JW8 125+123 Ref JW8 124+126 DNA Primers

22 7 13 1. Raios  causando quebras em um diplóide em G2. Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica

23 7 13 2. Recombinação ectópica entre sítios homeólogos. Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica

24 7 13 3. Recombinação ectópica entre sítios homeólogos. Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica

25 7 13 4. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte. Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica

26 4a. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte: Balanceada Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica 7 13/7 7 7/13 7 13 Diplóide com cariótipo normal Translocação balanceada

27 4b. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte: Desbalanceada. Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica 7 13/7 7 7/13 7 13 Translocação desbalanceada

28 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 1. Raios  causando quebras em um diplóide em G2.

29 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 1. Raios  causando quebras em um diplóide em G2, quebra no cromossomo 13.

30 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 2. Ressecção exonucleolítica 5’ - 3’ no DNA quebrado

31 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 3. Invasão da sequência doadora no cromossomo 7

32 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 4. Clivagem endonucleolítica das sequências 3’ não-homólogas

33 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 5. Replicação da fita contínua

34 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 6. Dissociação do cromossomo doador e replicação da fita descontínua

35 7 13 Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR) 6. Dissociação do cromossomo doador e replicação da fita descontínua

36 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Recombinação entre outros sítios homeólogos (HXT13/15) JW8 HXT13 HXT15 90% de identidade

37 Translocação não-reciproca do cr5 para o cr4 mediada pelos loci HXT13 e HXT15 HXT13 HXT15 Ref JW8 5F+5R Ref JW8 4F+4R Ref JW8 4F+5R Ref JW8 5F+4R DNA Primers 4F4R 5F5R

38 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 RefJW8 12 4 7+15 16+13 2 14 10 11 5+8 9 3 1+6 Amplificação interna no cromossomo 5 (~630Kb) JW8 Análise de aberrações cromossômicas específicas e modelos moleculares para o reparo das quebras no DNA.

39 Análise estrutural do cromossomo 5 de JW8 por Southern blot 5L AflII sonda 17.1kb 13.4kb 17.1kb Ref JW8 Ref JW8 Parental 17.1kb Duplicação 13.4kb 23.1kb 9.4kb 6.5kb 4.3kb 2.3kb 2.0kb Ref Ty1 JW8 Ty1 Região duplicada no cromossômo 16 humano: ~15 Mb Genôma de S. cerevisiae: ~13 Mb

40 5 1. Raios  causando quebras em um diplóide em G2. Permuta mitótica desigual como mecanismo de criação de aberrações cromossômicas estruturais

41 5 2. Reparo por conversão gênica ou permuta no locus: Reparo correto. Permuta mitótica desigual como mecanismo de criação de aberrações cromossômicas estruturais 5

42 5 3. Reparo por permuta desigual: Duplicação e deleção. Permuta mitótica desigual como mecanismo de criação de aberrações cromossômicas estruturais 5 JW8

43 Observações principais: - As quebras de fita dupla (DSBs) foram reparadas principalmente através recombinação homóloga em células diplóides sincronizadas em G2; - Entretanto, a maioria dos indivíduos sobreviventes apresentou aberrações cromossômicas estruturais formadas provavelmente por recombinação homóloga ectópica; - A maioria dos sítios de resolução (breakpoints) foi detectada em regiões de sequência repetitiva incluindo inserções Ty completas e ancestrais, além de famílias de genes (HXT e FLO); - Aberrações numéricas tanto de ganho como de perda de cromossômos completos foram detectadas entre os sobreviventes; - Uma região de aproximadamente 50kb no cromossômo 5 apresentou a maior concentração de aberrações estruturais, representando 25% do total de “breakpoints”.

44 Planos para o futuro 1: Análise do “hotspot” no cromossomo 5 ~ 50kb   Ty1  - Aberrações detectadas em 8 das 37 colônias sobreviventes analizadas JW2 A2 JW5 JW12 A24 JW3 JW8 JW9

45 ~ 50kb   Ty1  - Esta região contém 12 dos 47 “breakpoints” (~25%) posicionados em inserções Ty. - A frequência de aberrações nessa região é muito superior à incidência esperada para a inserção Ty média ( p = 0.002 ). Número de “breakpoints” por sítio Número de sítios Distribuição dos 47 “breakpoints” nas 46 inserções Ty completas do genôma de S. cerevisiae Planos para o futuro 1: Análise do “hotspot” no cromossomo 5 Colaboração com Duke e NIEHS $$$

46 Planos para o futuro 2: Análise de aberrações cromossômicas durante processos fermentativos. Inóculo inicial no começo da safra Reutilização do inóculo por vários meses Acumulação de rearranjos cromossômicos Caracterização dos eventos por campo pulsado, microarranjos e mapeamento físico Implicações tecnológicasEstudo da dinâmica de populações durante o processo fermentativo

47 Planos para o futuro 3: Regulação e reparo de quebras de fita dupla durante a recombinação meiótica. - Análise do papel de enzimas modificadoras de histonas no controle da formação de quebras meióticas. - Papel de mecanismos de reparo de bases mal pareadas “Mismatch repair” no controle da conversão gênica meiótica.

48 Agradecimentos - Jim Westmoreland and Mike Resnick (NIEHS) - Gosia Gawel, Piotr Mieczkowski, e Tom Petes (Duke) - Membros do Petes Lab. Suporte Financeiro: National Institues of Health Duke University Medical Center

49

50 12 4 7+15 16+13 2 14 10 11 5+8 9 3 1+6 Ref A3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Possível translocação balanceada na colônia A3

51 Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais: Translocações, Deleções Síndrome cri-du-chat: Deleção no braço curto do cromossômo 5