João Daniel Arrabaça M ETABOLISMO E NERGÉTICO 2014/15 aulas teóricas AT 6 2. Mecanismos de transdução de energia Fosforilação ao nível do substrato Hipótese química

ADP oligomicina [O 2 ] tempo (min) ADP/O NADH ≈3 succinato ≈2 ascorbato ≈1 RLM + tampão + Pi + substrato ATP ADP ATP ADP ATP

ADP [O 2 ] tempo (min) desacoplador ADPATP ADP ATP

ADP [O 2 ] Tempo desacoplador ADPATP ADP ATP

Ca 2+ oligomicina [O 2 ] tempo (min) Ca 2+

oligomicina [O 2 ] tempo (min) Ca 2+ Ca 2+ /O NADHsuccascorb ≈3≈2≈1 Ca 2+ int

aa₃ b c A λ (nm) Cadeia respiratória mitocondrial Espectro diferencial dos citocromos + Na-ditionito + antimicina

NADH NAD succinato O2H2OO2H2O ascorbato rotenona piericidina amital antimicina A mixotiazolo KCN CO bca Cadeia respiratória de mitocôndrias de células animais Inibidores

CI CII CIII CIV c NAD FAD b c 1 a3 aa3 a NADH succinato O2O2 UQ UQH 2 UQ UQH 2 UQ UQH 2 rotenona piericidina antimicina A mixotiazolo Fe-S CN

NADH succinatoascorbato rotenona O2O2 antimicina mixotiazolo KCN transporte de catiões ~ ADPATP oligomicina trans-hidrogenase desacopladores

Proponente da hipótese química da fosforilação oxidativa Desempenhou um papel fundamental no desenvolvimento dos conhecimentos sobre o acoplamentoi energético na fosforilação oxidativa Descobridor da características fundamentais do funcionamento das cadeias respiratórias e das ATPsintases mitocondriais e bacterianas E. (Bill) C. Slater 1917 – Lars Ernster 1920 – 1998

Hipótese Química (Slater 1957) Paralelismo entre os mecanismos glicolítico e respiratório de fosforilação de ADP A red + B ox A ox ~X+ B red inibidores TE A ox ~X + Y A red + X~Y Y~PY~P X~Y+P desacopladores ADP~P + YY~P + ADP oligomicina

Proponente da teoria quimiosmótica do acoplamento energético, na fosforilação oxidativa e na fotofosforilação. Realizou as experiências tendentes a demostrar a falsiabilidade da teoria, de acordo com os postulados de Karl Popper para as teorias científicas aplicados, pela primeira vez, em Biologia Prémio Nobel da Química(1978) Peter D. Mitchell 1920 – 1992 Karl R. Popper 1902 – 1994 Filósófo da Ciência, pretende que a repetição de resultados compatíveis não valida uma teoria e que uma teoria científica deveria conter os critérios para a sua falsiabilidade experimental. A teoria quimiosmótica é a primeira teoria em Biologia, que obedece a estes pressupostos

Teoria Quimiosmótica (Peter Mitchell, ) Postulados 1.As membranas transdutoras (membrana interna mitocondrial, membrana tilacóidal, membrana plasmática bacteriana) são impermeáveis a H + 2. As cadeias de transporte de electrões, na fosforilação oxidativa e na foto- fosforilação, funcionam como bombas de H +, formando um gradiente electroquímico de H + (Δ μ H + ) 3. As ATPsintases (ATPase) mitocondriais, tilacóidais e bacterianas, funcionam como bombas reversíveis de H +, formando (hidrólise de ATP) ou utilizando (fosforilação de ADP) um gradiente electroquímico de H + 4. Os desacopladores impedem a formação do gradiente electroquímico de H +, pois tornam as membrana transdutoras permeáveis aos H + 5. O imbalanço osmótico causado pelo transporte de H + é anulado pelo transporte específico de metabolitos, através das membranas transdutoras

[H + ] tempo H2O2H2O2 desacoplador RLM + substrato +catalase anaerobiose Experiências de Mitchell & Moyle ATP desacoplador [H + ] tempo RLM + inibidor TE desacoplador oligomicina

lantânio 3+ vermelho de ruténio (inibidores do transportador) H+H+ int ext mi CR [Ca 2+ ] int >>[Ca 2+ ] ext no estado estacionário substrato CR Inibidores TE desacopladores Ca 2+

transportador de ATP/ADP ADP 3- ATP 4- oligomicina carboxiatractilósido atractilósido transportador de fosfato Pi - OH - NEM mersalil transportador de dicarboxilatos malato 2- Pi - butilmalonato transportador de triicarboxilatos 1,2,3- benzil -tricarboxilato citrato +H 3- + malato 2- transportador de  cetoglutarato  -cetoglutarato 2- malato 2- fenil- succinato transportador de piruvato - OH - ciano-hidroxicinamato transportador de glutamato/aspartato aspartato - glutamato - + H + transportador de glutamato - OH -

intext efeito sobre ∆  ∆pH cadeia respiratória ATP sintase K+K+ SCN - valinomicina nigericina K+K+ H+H+ FCCP H + K+K+ H + K + valinomicina + nigericina H + -+ H +

pH 4,0 Suspensão de tilacóides de folhas de espinafre pH 7,0 Tampão pH 7,0 pH 7,0 succinato pH 4,0 succinato H+H+ H+H+ ATP ADP+P + base não-penetrante, pH 7,0 + ADP + 32 Pi Experiências de Jaggendörf (1966) tampão succinato pH 4,0