Estrutura Gênica e Definição de Termos Gene: toda a seqüência de ácido nucléico que é necessária para a síntese de um polipeptídeo funcional ou molécula de RNA. Promotor: a seqüência mínima necessária do DNA que é reconhecida pela RNA polimerase para que a transcrição se inicie corretamente. Faz parte do gene. Elementos Reguladores em Cis: elementos que regulam a iniciação da transcrição. Unidade de Transcrição : segmento de DNA que codifica a seqüência no transcrito primário.

Estrutura Gênica e Definição de Termos (2) Transcrição: processo de formação de RNA a partir de uma fita molde de DNA. Tradução: processo de formação de uma proteína nos ribossomos usando o RNAm para determinar a seqüência de aminoácidos. Splicing: Corte seletivo do transcrito primário. Exon: segmento do DNA que é transcrito em RNA e traduzido em proteína. Intron: Segmento de DNA que é transcrito para o RNA, mas é cortado antes da tradução.

EXPRESSÃO GÊNICA A expressão gênica é o processo em que a informação contida em um determinado gene é decodificada em uma proteína. Regulação da expressão gênica em qualquer uma das etapas do processo pode levar a uma expressão gênica diferencial.

Objetivos da regulação da expressão gênica Bactérias: o controle da expressão gênica serve principalmente para permitir que as células se ajustem às mudanças nutricionais no ambiente, de forma que o seu crescimento e divisão sejam otimizados. Organismos multicelulares: a expressão gênica controlada regula um programa genético fundamental para o desenvolvimento embrionário e a diferenciação.

Como uma célula controla quais proteínas que ela fabrica? Controlando quando e como um determinado gene é transcrito; Controlando como um transcrito primário de RNA sofre o “splicing” ou é processado; Selecionando quais RNAm são traduzidos; Ativando ou inativando seletivamente as proteínas depois da sua síntese.

Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos

Expressão gênica em bactérias

Lac operon de E. coli Operon Lac operon Séries de genes que codificam para produtos específicos e os elementos reguladores que controlam esses genes Lac operon Segmento de DNA necessário para a produção de enzimas responsáveis pelo metabolismo da lactose

Lac operon Operador Promoter Genes estruturais segmento do DNA no qual se liga uma proteína inibidora que bloqueia a transcrição. Promoter segmento do DNA reconhecido pela RNA polimerase e que promove a transcrição. Genes estruturais Genes que codificam para polipeptídeos específicos

Lac operon Genes estruturais para o metabolismo da lactose são expressos apenas quando a lactose está presente no meio de incubação da bactéria. Como o operon controla a expressão dos genes? Repressão Ativação

Repressão Quando a lactose está ausente Um proteína repressora liga-se ao DNA na seqüência do operador Impede a ligação da RNA polymerase ao DNA Não ocorre transcrição das enzimas que metabolizam lactose O controle da transcrição é devido ao gene regulador que codifica para a produção da proteína repressora

Ativação Início da transcrição ocorre com a retirada da proteína repressora Quando a lactose está presente Lactose liga-se à proteína repressora no operador A proteína repressora desliga-se do DNA RNA polimerase pode iniciar a transcrição dos genes estruturais Lactose é o indutor, pois sua presença resulta na indução da expressão dos genes

Expressão Gênica em Eucariotos Genomas são muito maiores em eucariotos do que em procariotos DNA dos eucariotos está localizado em vários cromossomos ao invés de um único cromossomos circular dos procariotos. Os eukariotos são geralmente multicelulares Diferentes tipos células precisam produzir diferentes proteínas Nem todos os genes serão expressos em todas as células Não são encontrados operons nos eucariotos.

Expressão gênica diferencial

Morfogênese: plantas vs. animais Movimentos de células e tecidos são necessários no desenvolvimento embrionário para chegar à forma final do organismo. Continuidade do desenvolvimento nos adultos restrito à diferenciação de células continuamente repostas ao longo da vida. Plantas: Morfogênese e crescimento ao longo de toda a vida da planta; Meristemas apicais mantém-se com características embrionária, responsáveis pelo contínuo crescimento das plantas.

Expressão gênica diferencial As diferenças entre células advém das diferença na expressão gênica (genes ligados e desligados), e não da diferença nos genomas. Evidências: Equivalência Genômica : todas as células de um organismo tem os mesmos genes. Totipotência: células podem manter o potencial zigótico para formar todas partes do organismo maduro (células vegetais; clonagem) Determinação: restrição do potencial de desenvolvimento, resultando na limitação das possibilidades de desenvolvimento de cada célula à medida que o embrião se desenvolve; alteração nos RNAm transcritos.

Determinação  Diferenciação Determinação: à medida que o embrião se desenvolve, o destino possível de cada célula torna-se mais limitado. Diferenciação: especialização das células depende do controle da expressão gênica Indução: a habilidade de um grupo de células embrionárias em influenciar o desenvolvimento de outro; determinantes citoplásmicos que regulam a expressão gênica Genes homeóticos : genes que controlam o plano corporal global através do controle do destino de desenvolvimento de grupos de células

Diferenças na Iniciação da Transcrição em Eucariotos e Bactérias (1) RNA-polimerase: Bactérias contêm um único tipo de RNA-polimerase, Células eucarióticas apresentam três tipos RNA-polimerase I, RNA-polimerase II e RNA-polimerase III. Início da transcrição: A RNA-polimerase bacteriana é capaz de iniciar a transcrição sem o auxílio de proteínas adicionais. As RNA-polimerases eucarióticas precisam da ajuda de várias proteínas: os fatores gerais de transcrição.

Diferenças na Iniciação da Transcrição em Eucariotos e Bactérias (2) Seqüências reguladoras : Em eucariotos, podem estar localizadas no DNA a milhares de pares de nucleotídeos distante do promotor Em bactérias os genes são freqüentemente controlados por uma única seqüência regulatória, tipicamente localizada próxima ao promotor. A iniciação da transcrição em eucariotos deve levar em consideração a compactação do DNA nos nucleossomos e as formas mais compactas da estrutura da cromatina.

As Três RNA-Polimerases das Células Eucarióticas RNA-polimerase I - transcreve os genes para rRNA. RNA-polimerase II - transcreve todos os genes que codificam proteínas, mais alguns genes que codificam pequenos RNAs (p.ex., aqueles presentes nos “spliceossomos”). RNA-polimerase III – transcreve os genes de tRNAs, rRNA 5S e genes para pequenos RNAs estruturais.

Fatores Gerais de Transcrição Os fatores gerais de transcrição são responsáveis pelo posicionamento correto da RNA-polimerase no promotor, ajudam na separação das fitas de DNA para permitir o início da transcrição, e liberam a RNA-polimerase do promotor quando a transcrição se inicia.

Etapas na formação do complexo de iniciação da transcrição em eucariotos TFIID liga-se a região TATA, possibilitando a ligação de TFIIB. A seguir ligam-se o TFIIF e RNA-polimerase II. TFIIE, TFIIH e TFIIJ então se juntam ao complexo. TFIIH usa ATP para fosforilar a RNA-polimerase II, mudando a sua conformação de forma que a RNA-polimerase é liberada do complexo e é capaz de iniciar a transcrição.

Fatores de Transcrição Seletivos Os promotores isolados são geralmente ineficientes. Fatores de transcrição seletivos que se ligam à região “upstream” e a “enhancers” aumentam a iniciação. Em alguns casos, proteínas adicionais (mediadores, coativadores) são requeridos para estimular a transcrição. Proteínas que se ligam a seqüências de “enhancer” devem atuar de forma semelhante àquelas que se ligam próximas ao promotor. O DNA entre o “enhancer” e o promotor forma uma alça para permitir que as proteínas ativadoras ligadas ao “enhancer” façam contato com as proteínas ligadas ao promotor. as proteínas reguladoras da expressão gênica (repressores e ativadores) podem influenciar a iniciação da transcrição, mesmo quando estão ligadas no DNA a milhares de pares de nucleotídeos distante do promotor.

Fatores de Transcrição Seletivos

Domínios Funcionais dos Fatores de Transcrição Seletivos Domínio de ligação ao DNA - liga a proteína no sítio de ligação do DNA. Seqüências de localização nuclear – requeridas para transporte para dentro do núcleo. Domínio de ativação transcricional - realiza o contato com os fatores gerais de transcrição. Região de dimerização – requerido para formar homo- ou heterodímeros com outras proteínas. Domínio de ligação de ligante – necessário para ligação de composto que pode funcionar como ativador do fator.

Motivos de ligação nos fatores de transcrição Homeodomínio – consiste de três -hélices adjacentes. A maior parte do contato com as bases do DNA é feita pela hélice 3. Exemplos: proteínas Hox e outras proteínas reguladoras do desenvolvimento. Dedo de zinco (Zinc finger) - Esse motivo é constituido de uma -hélice e uma folha  pregueada unidas por um íon zinco. Exemplos: receptores de hormônios esteróides, Sp1. Região básica e zíper de leucina (ou bZip) – A região básica serve para o contato com o DNA e o zíper de leucina serve para a formação do dímero. Exemplos: Fos, Jun (complexos Fos-Jun teriam função central na mediação de resposta nuclear a sinais na superfície celular) Hélice-alça-hélice – Contém um motivo estrutural muito semelhante a b-zip, exceto que uma alça não helicoidal separa as duas -hélices em cada monômero. Exemplo: MyoD (fator regulador importante na determinação e diferenciação de músculo).

Zipper de leucina

Genes Eucarióticos São Regulados por Combinação de Proteínas A maioria das proteínas reguladoras de genes atuam como parte de um “comitê” de proteínas reguladoras, todas essenciais para a expressão de um determinado gene na célula correta, em reposta a uma dada condição, no tempo certo e no nível requerido. O termo controle combinatorial refere-se a forma como grupos de proteínas trabalham juntas para determinar a expressão de um único gene.

Ação de fatores de transcrição gerais e seletivos

Uma Única Proteína Pode Coordenar a Expressão de Diferentes Genes Embora o controle da expressão gênica em eucariotos seja combinatorial, o efeito de uma única proteína reguladora pode ser decisiva para ligar e desligar, simplesmente completando a combinação necessária para ativar ou reprimir um gene. Exemplo: Em seres humanos, o receptor de glicocorticóide. Para se ligar aos sítios no DNA o receptor precisa formar um complexo com uma molécula de um hormônio esteróide (p.ex. cortisol). Em resposta aos hormônios glicocorticóides, as células do fígado aumentam a expressão de vários genes.

Efeito de uma Única Proteína Reguladora na Diferenciação Estudos com células musculares em diferenciação, em cultura, possibilitaram a identificação de proteínas reguladoras importantes, expressadas somente em células musculares, que coordenam a expressão gênica. Quando o gene que codifica uma dessas proteínas reguladoras, MyoD, é introduzido em fibroblastos, eles passam a se comportar como mioblastos e fundem-se para formar células semelhantes às musculares.

Um Único Gene que Codifica uma Proteína Reguladora Pode Estimular a Formação de um Órgão Inteiro Estudos sobre o desenvolvimento de olho em Drosophila, camundongo e humanos mostraram que um único gene que codifica uma proteína reguladora (Ey em moscas flies e Pax6 em vertebrados) é crucial para o desenvolvimento do olho. Quando expressado num tipo celular apropriado, Ey pode desencadear a formação do órgão inteiro (olho), composto de diferentes tipos de células, todas corretamente organizadas no espaço tridimensional.

Influência da Estrutura da Cromatina na Transcrição em Eucariotos A maior parte do DNA em uma célula eucariótica está complexada nos nucleossomos e a estrutura espiralada dificulta o acesso de fatores de transcrição e RNA-polimerase. A iniciação da transcrição depende da remoção dos nucleossomos da região promotora do gene. Durante a síntese de DNA, quando os nucleossomos são substituídos, poderia haver competição entre as histonas e os fatores de transcrição (p.ex. TFIID) pelos sítios promotores. A ligação e ruptura dos nucleossomos por ativadores.

Empacotamento do DNA e expressão gênica O empacotamento do DNA ao redor das histonas pode silenciar grandes trechos do genoma, às vezes de maneira não reversível.

Ruptura e Reorganização do Nucleossomo Complexos poderiam estar envolvidos na ruptura dos nucleossomos: Participação de fator GAGA e fator de remodelamento de nucleossomo (nucleosome-remodeling factor, NURF) Participação de complexo SW1/SNF Existe uma boa correlação entre acetilação de histona e a atividade transcricional da cromatina. Competição entre histonas e fatores de transcrição poderia estar envolvida no controle da expressão gênica.

Desmontagem dos nucleossomos Enquanto o TATA box está enovelado no nucleossomo, não se inicia a ligação dos fatores de transcrição gerais

Regiões Controladoras de Lócus (Locus Control Regions, LCRs) Regiões controladoras de lócus (LCRs) são seqüências de DNA essenciais para o estabelecimento de uma configuração “aberta” da cromatina. Elas são capazes de inibir a transcrição normal de áreas relativamente grandes contendo vários genes. Um dos mais bem estudados é o LCR que controla a expressão tecido-específica da família de -globin.

Expressão diferencial em função da etapa do desenvolvimento

“Splicing” diferencial do transcrito primário

Metilação do Promotor e Inatividade Gênica Em células sangüíneas vermelhas de humanos e galinhas, o DNA envolvido na síntese de globina está completamente (ou quase completamente) não-metilado. O gene de ovalbumina de galinha não está metilado nas células do oviduto, mas metilado nos outros tecidos. Nos somitos de camundongo, a demetilação de um “enhancer” de MyoD antecede a transcrição de MyoD e é essencial para a especificação dessas células como precursoras de músculo.

Um pouco de regulaçao da expressão gênica nos separa dos ... Genomas 98,5% idênticos