REVISÃO CAP 7 E 8 Profª Emanuelle Grace

CAP 7 EXPRESSÃO DOS GENES

Nucleotídeo – unidade básica do DNA Nucleotídeo : pentose (desoxirribose) + base nitrogenada + fosfato Purinas Pirimidinas

Estrutura do DNA Os nucleotídeos se ligam uns aos outros de forma linear – ligação fosfodiéster

sintetizado no núcleo a partir do DNA Estrutura do RNA Pentose : ribose (diferente do DNA) No lugar da timina, no caso do RNA, uracila RNA mensageiro sintetizado no núcleo a partir do DNA TRANSCRIÇÃO

Código genético A cada 3 nucleotídeos no DNA, forma-se um CÓDON A seqüência destes códons no DNA é copiada em RNA mensageiro Cada códon codifica um aminoácido, que é a unidade básica da estrutura das proteínas A seqüência dos aminoácidos, determinada pela sequência de códons é que dá origem às diferentes proteínas

Códons

Dogma central da biologia molecular Proteínas

Conceito de gene Um segmento de DNA que tem a informação necessária para a síntese de uma proteína Composto por : regiões codificantes – éxons regiões não-codificantes - íntrons

Informação para síntese protéica

Estrutura do gene I INTRONS 3` 5` EXONS As regiões codificadoras são chamadas de éxons e são alternadas por regiões não-codificadoras, chamadas de íntrons

Estrutura do gene II Posteriormente a transcrição, ocorre o splicing para retirada dos introns, ficando somente a parte codificadora do gene,exons, para orientar a tradução da proteína.

Processamento normal do RNA  SPLICING: retirada dos introns, ficam somente os exons

Controle pós-transcricional : splicing alternativo Os genes eucarioticos podem ter tamanhos diferentes gerados por splicing do RNA. O termo splicing quer dizer combinação. Neste processo as sequencias dos introns são removidas do RNA mensageiro. Uma célula pode dividir o transcrito primário de diferentes maneiras, o que irá gerar polipeptídeos diferentes originados do mesmo gene, porém de transcritos diferentes. Neste caso, em que várias isoformas são geradas, diz-se que ocorre splicing alternativo. Pelo menos um terço dos genes humanos produzem multiplas proteinas dessa forma. Quando existe possibilidade de combinações diferentes em várias posições do transcrito, um único gene pode produzir várias proteinas diferentes. Assim, a compelxidade protéica de uma célula ultrapassa muito o número de genes que ela possui. Combinações diferentes de éxons – um gene, várias proteínas

Dogma central da biologia molecular Igual para todas as células Transcrição Diferentes RNAs podem ser gerados Tradução A descoberta de combinacoes alternativas de exons, ou seja, do splicing alternativo. Definição antiga – região do genoma gerada como unidade separada na meiose e que dá origem a uma caracteristica fenotípica. Um gene, uma proteina. Depois veio outra definição para gene: sequencia de DNA que é transcrita em RNA e codifica uma proteina Com a descoberta do splicing: sequencia de DNA que é transcrita como unidade separada e que codifica um grupo de proteínas semelhantes (isoformas) Diferentes proteínas podem ser geradas

CAP 8 MELHORAMENTO GENÉTICO Ciências . Aula 03 Biotecnologia O que é BIOTECNOLOGIA? EMANUELLE GRACE

O que é BIOTECNOLOGIA? Ciências . Aula 03 Biotecnologia Biotecnologia é a utilização de agentes biológicos para prover bens e assegurar serviços. Mesmo assim ficaríamos cheios de dúvidas: quais agentes biológicos? Quais os conhecimentos básicos necessários? O que devemos entender por bens ou serviços? Vejamos o quadro a seguir: Microbiologia, Bioquímica, Genética, Engenharia, Química, Informática Microrganismos, Células e Moléculas (Enzimas, Anticorpos, DNA, etc.) CONHECIMENTO AGENTES BIOLÓGICOS BIOTECNOLOGIA BENS SERVIÇOS Alimentos, Bebidas, Produtos Químicos, Energia, Produtos Farmacêuticos, Pesticidas, etc. Purificação da água, Tratamentos de resíduos, Controle de poluição, etc.

DNA: ácido desoxirribonucléico O alvo da Biotecnologia Ciências . Aula 03 Biotecnologia DNA: ácido desoxirribonucléico O alvo da Biotecnologia Composto por duas fitas complementares, unidas por pontes de hidrogênio entre bases púricas (A,G) e bases pirimídicas (T,C).

Teste de paternidade Ciências . Aula 03 Biotecnologia O teste de paternidade, também chamado de teste de DNA, permite comparar as informações genéticas do DNA da criança com aquelas encontradas no DNA do suposto pai. Basta uma pequena amostra de sangue dos envolvidos (suposto pai, mãe e filho) para que haja 99,99% de certeza do resultado.

Teste de paternidade: como é feito? Ciências . Aula 03 Biotecnologia Teste de paternidade: como é feito? As partes envolvidas na investigação (mãe, pai e filho) vão a um laboratório, onde uma pequena amostra de sangue dos três é coletada em um papel-filtro, sem utilização de seringa. No caso de morte de alguma das partes, pede-se a exumação do corpo e a coleta de uma parte do organismo; em geral, um fêmur. O material pode ser coletado em laboratórios diferentes. Para que não haja confusão com troca de materiais, assim que o sangue é coletado, o papel-filtro é etiquetado e recebe a assinatura de cada envolvido. A coleta está pronta para ser mandada para um laboratório especializado em exames de DNA. Do papel-filtro são retirados pequenos discos do tamanho da ponta de uma caneta. O material é levado para uma espécie de banho-maria. Através de uma espécie de aquecimento e resfriamento, faz-se com que o DNA contido na coleta seja amplificado.

Teste de paternidade: como é feito? Ciências . Aula 03 Biotecnologia Teste de paternidade: como é feito? 4. Após a amplificação das moléculas de DNA, o material é levado para o seqüenciador automático, uma sofisticada máquina onde o código genético será seqüenciado. 5. Finalmente, um computador lê a seqüência e já pode dar um primeiro veredicto. Mesmo assim, as seqüências são analisadas por um especialista em genética, uma vez que mutações no código podem levar a máquina a cometer enganos. Cada teste é revisto através de um processo de prova e contraprova. Seqüenciador: Megabase Resultado liberado pelo Megabase

Teste de paternidade Ciências . Aula 03 Biotecnologia Passos para inclusão e exclusão de paternidade pelo DNA: Compare as bandas da mãe (M), criança (C) e possíveis pais (P). 2) Identifique quais bandas da criança vieram da mãe. As bandas restantes (bandas-teste) vieram do pai. 3) As bandas-teste estão presentes no possível pai? Identifique-o.

Transgênicos Ciências . Aula 03 Biotecnologia Transgênicos são organismos que, mediante técnicas de engenharia genética, contêm material genético de outros organismos. A geração de transgênicos visa à obtenção de características específicas por um organismo de interesse. A manipulação genética recombina características de um ou mais organismos de uma forma que provavelmente não aconteceria na natureza. Por exemplo, podem ser combinados os DNAs de animais e plantas. O primeiro transgênico foi a bactéria Escherichia coli, que sofreu adição de genes humanos para a produção de insulina na década de 1980.

Como cortar e colar fitas de DNA de diferentes seres vivos? Ciências . Aula 03 Biotecnologia Como cortar e colar fitas de DNA de diferentes seres vivos?

Alimentos transgênicos Ciências . Aula 03 Biotecnologia Alimentos transgênicos São alimentos cujas sementes tiveram seu material genético modificado em laboratório. Essas sementes são modificadas para que as plantas possam resistir às pragas de insetos e à grandes quantidades de pesticida.

Alimentos transgênicos Ciências . Aula 03 Biotecnologia Alimentos transgênicos Aspectos positivos:    Aumento na produção de alimentos. Alteração do valor nutricional dos alimentos. Desenvolvimento de espécies com características desejáveis. Maior resistência dos alimentos ao armazenamento por períodos maiores. Aspectos negativos:   A maior resistência a agrotóxicos e antibióticos nas pessoas e nos animais. A eliminação de populações benéficas como abelhas, minhocas e outros animais e espécies de plantas. O empobrecimento da biodiversidade. O desenvolvimento de ervas daninhas muito resistentes que podem causar novas doenças e o desequilíbrio da natureza. O desconhecimento das conseqüências da utilização dos alimentos geneticamente alterados a longo prazo.       

Alimentos transgênicos Ciências . Aula 03 Biotecnologia Alimentos transgênicos Ultimamente, com o avanço da engenharia genética, vários estudos e trabalhos científicos tem demonstrado avanços significativos na manipulação de material genético de plantas e outros seres vivos. Alvos de discussões sobre suas vantagens e desvantagens, a ciência dos transgênicos está em pleno desenvolvimento. Ambientalistas acusam os alimentos transgênicos de causar impactos irreversíveis ao meio ambiente. Os alimentos transgênicos são modificados geneticamente em laboratórios com o objetivo de conseguir melhorar a qualidade do produto. Os genes de plantas e animais são manipulados e muitas vezes combinados. Os organismos geneticamente modificados, depois da fase laboratorial, são implantados na agricultura ou na pecuária. Vários países estão adotando este método como forma de aumentar a produção e diminuir seus custos. Embora existam muitos argumentos contrários, a técnica, como já mencionado , pode aumentar a produtividade e resistência em relação à planta tradicional.

Clonagem: definição e técnica básica Ciências . Aula 03 Biotecnologia Clonagem: definição e técnica básica Clonagem é basicamente a produção de indivíduos geneticamente iguais. É um processo de reprodução assexuada que resulta na obtenção de cópias geneticamente idênticas de um mesmo ser vivo.

Clonagem da Dolly Ciências . Aula 03 Biotecnologia A ovelha Dolly (5 de julho 1996 - 14 de fevereiro 2003) foi o primeiro mamífero a ser clonado com sucesso a partir de uma célula adulta. Dolly foi gerada a partir de células mamárias de uma ovelha adulta com cerca de seis anos, através de uma técnica conhecida como transferência somática de núcleo. Apesar das suas origens, Dolly teve uma vida normal de ovelha e deu à luz dois filhotes, sendo cuidadosamente observada em todas as fases. Em 1999, foi divulgado na revista Nature que Dolly poderia desenvolver formas de envelhecimento precoce, uma vez que os seus telômeros (partes de alguns cromossomos) eram mais curtos que os das ovelhas normais. Esta questão iniciou uma acesa disputa na comunidade científica sobre a influência da clonagem nos processos de envelhecimento, que está ainda hoje por ser resolvida. Em 2002 foi anunciado que Dolly sofria de um tipo de artrite degenerativa, o que foi interpretado por alguns sectores como sinal de envelhecimento. Dolly foi abatida em fevereiro de 2003 para evitar a sua morte dolorosa por uma infecção pulmonar incurável.

Clonagem da ovelha Dolly Ciências . Aula 03 Biotecnologia Clonagem da ovelha Dolly

Vacina gênica Ciências . Aula 03 Biotecnologia Apontada pelos cientistas como promessa no combate a doenças infecciosas como a malária, a dengue e, até mesmo, a AIDS, a vacina gênica é uma nova estratégia para a prevenção de doenças onde o conhecimento das técnicas relacionadas ao DNA tem um papel essencial.

E como esta vacina é feita? Vacina gênica Retira-se de uma seqüência de DNA do agente causador Essa sequencia codifica uma proteína capaz de estimular o nosso sistema imune. O fragmento de DNA é clonado e inserido em vetores. Aplica-se em animais, os quais passam a traduzir as seqüências do agente causador da doença, Ocorre a produção da proteína do causador O sistema imune irá reconhecê-la como não-própria do organismo, Desencadeia-se a formação de anticorpos e células de memória.

Ciências . Aula 03 Biotecnologia Vacina gênica

Vacina gênica Ciências . Aula 03 Biotecnologia Vacina gênica O método é considerado mais eficaz e seguro (oferece além de segurança uma resposta imunológica duradoura, não sendo necessária a aplicação de outras doses). do que o de determinadas vacinas convencionais, que inoculam vírus ou bactérias vivas e atenuadas na pessoa para obrigar o sistema imunológico a produzir anticorpos ou imunidade celular. Essas vacinas de organismos vivos e atenuados, embora funcionem muito bem, oferecem uma certa margem de risco de que a pessoa acabe contaminada pela doença que se pretende prevenir. Com a vacina de DNA isso não acontece.

Vacina gênica Ciências . Aula 03 Biotecnologia Um exemplo de vacina de DNA que vem trazendo bons resultados é a da raiva. Testada em macacos, os pesquisadores obtiveram 100% de imunização dos animais. Eles foram expostos (desafiados) à doses letais do vírus da raiva e não desenvolveram a doença. Esta é uma boa notícia, tendo em vista que surgem no mundo, a cada ano, mais de 40.000 novos casos de raiva. A vacina de DNA abre novas portas, trazendo esperança para a solução de doenças como a AIDS e a malária, para as quais ainda não foram obtidas vacinas eficazes.

Terapia gênica Ciências . Aula 03 Biotecnologia A terapia gênica consiste basicamente na introdução de genes em células ou tecidos com o intuito de corrigir deficiências genéticas. Esses genes são colocados dentro de células através da utilização de vetores, que podem ser de origem viral ou não-viral. Devido à capacidade intrínseca dos vírus de invadir e fazer com que seu genoma seja transcrito pela maquinaria celular, alguns tipos de vírus são modificados e utilizados como vetores para terapia gênica. Apesar da maioria dos protocolos de terapia gênica estar em estágios iniciais de desenvolvimento, essa área desperta interesse por seu potencial para o tratamento de uma grande diversidade de doenças.

Terapia gênica Ciências . Aula 03 Biotecnologia Um gene normal é colocado dentro do genoma para substituir um gene anormal, causador de alguma doença. A molécula carreadora, denominada vetor, é usada para levar o gene terapêutico para as células-alvo do paciente. O vetor viral, portanto, leva o material contendo o gene humano terapêutico para dentro da célula-alvo. A geração de uma proteína funcional, produto do gene terapêutico, restabelece a célula-alvo, o que pode representar a cura da doença.

PROJETO GENOMA HUMANO Constituído por cerca de 3 bilhões de pares de nucleotídeos. 3 % correspondem a genes e 97% a seqüências não codificantes. O tamanho do genoma não é diretamente proporcional ao numero de proteínas traduzidas.

BIOTECNOLOGIA, um “trilho” perigoso? Ciências . Aula 03 Biotecnologia Bioética Bioética é o estudo transdisciplinar entre biologia, medicina e filosofia (desta, especialmente as disciplinas de Ética, Moral e Metafísica), que investiga todas as condições necessárias para uma administração responsável da vida humana (em geral), da pessoa (em particular) e da biotecnologia. Considera, portanto, a responsabilidade moral de cientistas em suas pesquisas, bem como de suas aplicações. São temas dessa área questões delicadas como a clonagem, os transgênicos, a terapia gênica, dentre outras. BIOTECNOLOGIA, um “trilho” perigoso?

Exercício 1 01.  a) Quais são as duas enzimas usadas na obtenção do DNA recombinante e como atuam nesse processo? 02.  O que é clonagem molecular?

RESPOSTA a) Enzimas de restrição, usadas para cortar o DNA em segmentos. DNA – ligase, enzima que une segmentos de DNAs diferentes formando o DNAr em bactérias.   02.  É a replicação do DNAr em bactérias.

Exercício 2 . Explique, sucintamente, como pode-se manipular geneticamente a bactéria E.coli de modo a produzir o hormonio de crescimento humano, usando o seguinte material: E.coli com plasmídeos, DNA com o gene para o hormônio do crescimento, enzima de restrição, ligase de DNA, equipamento para cultura de bactérias e para extrair e purificar o hormonio do crescimento.

RESPOSTA Deve-se clivar o DNA (plasmídio) da bactéria com a enzima de restrição, bem como o gene de interesse. Com a ajuda da DNA ligase, se faz a união dos dois DNA’s em seguida inocula o DNAr na bactéria que será cultivada em meio de cultura apropriado para seu crescimento e multiplicação. Posteriormente deve ser feito o isolamento e purificação do produto resultante da expressão do gene de interesse.

Exercício 3 O que são organismos transgênicos? Aponte 2 pontos positivos e 2 negativos dos transgenicos.

RESPOSTA São organismos que tiveram seu material genético modificado, pela inserção de outros genes “estranhos” à sua linhagem. Aumento da produtividade e valor nutricional de alimentos. A maior resistência a agrotóxicos e antibióticos nas pessoas e nos animais. A eliminação de populações benéficas como abelhas, minhocas e outros animais e espécies de plantas.

Exercício 4 Nas técnicas do rDNA transfere-se DNA de uma espécie para outra, bactéria por exemplo, com dois principais objetivos: obter múltiplas cópias de certos genes e obter proteínas úteis codificadas por certos genes. Dê um exemplo da utilização, na medicina e agricultura, de cada um destes objetivos.

Exercício 5 Enzimas de restrição são fundamentais à Engenharia Genética porque permitem: a passagem de DNA através da membrana celular; inibir a síntese de RNA a partir de DNA; c) inibir a síntese de DNA a partir de RNA; d) cortar DNA onde ocorrem seqüências específicas de bases; e) modificar seqüências de bases do DNA.

Exercício 6 As enzimas de restrição são sintetizadas:  a) apenas pelas bactérias; b) apenas pelos vírus; c) por vírus e bactérias; d) por todas as células procarióticas; e) por qualquer tipo de célula.