Genômica funcional e metagenômica Discentes:Dayane Andrade dos Reis Fernanda M. de Oliveira Henriette G. Moranza Docentes: Prof.Dr.Jesus A. Ferro Prof. Dr. Marcos Tulio

GENÔMICA A genômica é a ciência que estuda o genoma dos organismos a partir do seu sequenciamento completo, com o objetivo de entender a sua estrutura, organização e função. • Genômica Estrutural: determina a sequência de nucleotídeos de um genoma. Estuda a organização e estrutura dos genes, refere-se aos dados do sequenciamento de DNA; • Genômica Funcional: Genômica funcional é um campo da biologia molecular que descreve a função de genes e proteínas. Basicamente, a função de um gene é determinada quando são identificados os seus respectivos produtos gênicos.

Transcriptômica Proteômica Metabolômica RNAi Knockouts GENÔMICA FUNCIONAL Metabolômica RNAi Knockouts

TRANSCRIPTôMICA •Transcriptoma ou Transcritoma refere-se ao conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular. Para estudar o transcriptoma os pesquisadores utilizam métodos de análise em grande escala como: SAGE (analise serial da expressão gênica); Microarrays (microarranjos de cDNA); RNAseq.

sage SAGE (analise serial da expressão gênica) é uma técnica para quantificar em larga escala a expressão de genes de uma dada população de RNAs mensageiros. Esta técnica gera etiquetas (tags) de cDNA que são ligadas e seqüenciadas para, em seguida, serem analisadas e anotadas.

Microarrays A técnica de analise em larga escala conhecida como microarrays ou chips de DNA, permite uma visão global na busca de padrões de expressão gênica em amostras biológicas; Por meio da determinação da expressão de milhares de genes simultaneamente, esta tecnologia permite a comparação entre comportamentos moleculares de diversos tipos de linhagens e tecidos diferentes;

Rna SEQ RNA-Seq envolve seqüenciamento de cDNAs (DNA complementar), obtidos a partir da ação da enzima transcriptase reversa sobre RNAs mensageiros, utilizando tecnologias de seqüenciamento com alto rendimento; Permite: medição dos níveis de transcritos e determinar a estrutura funcional dos genes; Permite a quantificação dos níveis de expressão gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis mais baixos de expressão devido a sua alta sensibilidade; Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutações, indels, splicing alternativos;

Rna de interferênciA É uma maneira relativamente simples e rápida de inativar o gene e assim compreender as funções destes; Esse método explora o mecanismo natural usado em várias plantas, animais, fungos e protozoários para se proteger contra certos vírus e elementos transponíveis;

Introduz uma molécula dupla fita de RNA, cuja sequência de aminoácidos combina com a parte do gene a ser inativado em uma célula ou organismo; Depois que o RNA é processados ele hibridiza com o mRNA produzido pelo gene alvo e o direciona para degradação.

Knockout O nocaute  ou inativação de um gene é uma técnica genética que consiste em bloquear a expressão de um gene específico num organismo, substituindo o gene original em seu locus por uma versão modificada do mesmo, à qual se extraiu um ou vários exões para gerar uma versão não funcional, incapaz de produzir a proteína que codificava o gene original. O objetivo desta técnica é deduzir a atividade de um gene ou o papel biológico deste, com base em um fenótipo mutante.

PROTEÔMICA O termo proteômica foi introduzido em 1995 para descrever todas as proteínas que são expressas em um genoma (Anderson et al., 1996; Wilkins et al., 1996); Atualmente, proteômica é descrita como um método direto para identificar, quantificar e estudar as modificações pós-traducionais das proteínas em uma célula, tecido ou mesmo organismos. Não é uma característica fixa se altera com o desenvolvimento do tecido ou sob as condições em que o indivíduo se encontra;

Fundamenta-se em princípios bioquímicos, biofísicos e de bioinformática para quantificar e identificar as proteínas expressas;

Técnicas Aplicadas ao Estudo da Proteômica 2 técnicas utilizadas para análise: Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2DE) Separação, detecção e quantificação de proteínas Espectrometria de massa Identificação das proteínas através da bioinformática

Eletroforese Bidimensional (2DE) Introduzida na década de 70 A 2DE combina duas técnicas de separação: a primeira separação (primeira dimensão) Focalização isoelétrica (IEF) a segunda dimensão (2DE) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

No IEF, as proteínas são separadas por alta tensão em um gradiente de pH imobilizado em um gel de acrilamida até alcançarem a posição estacionária, onde a carga total é zero (pI). Na 2DE, as proteínas são separadas pelo peso molecular, também através de uma tensão, em gel de poliacrilamida. Após a coloração do gel, observa-se um perfil bidimensional de pontos (“spots”), sendo que em cada ponto há múltiplas cópias de uma proteína. A imagem deste perfil é posteriormente analisada através da bioinformática.

proteínas muito ácidas (pH menor que 3,5) ou básicas (pH maior que 9) Algumas limitações: proteínas muito ácidas (pH menor que 3,5) ou básicas (pH maior que 9) proteínas de baixa abundância proteínas hidrofóbicas No geral, a 2DE é um método de separação eficiente, pois todas as proteínas da amostra são separadas simultaneamente, fornecendo informações úteis: pI, massa molecular, expressão, abundância relativa e modificações pós-traducionais

Identificação das Proteínas Uma das técnicas mais utilizadas para a identificação das proteínas é a análise do “fingerprinting” da massa precisa de um número de peptídios derivados da mesma proteína

Metabolômica Se refere ao conjunto de todos os metabólitos que são produzidos e/ou modificados por um organismo. Compreende uma grande variedade de compostos químicos de baixa massa molecular (<1000 Da), que apresentam propriedades químicas diversas; De espécies iônicas a carboidratos hidrofílicos, álcoois e cetonas voláteis, aminoácidos e ácidos orgânicos, lipídeos hidrofóbicos e produtos naturais complexos. Os níveis dos metabólitos representam uma informação integrativa da função molecular, definindo assim o fenótipo de uma célula ou tecido, em resposta a alterações ambientais ou genéticas. A identificação desses níveis é um complemento fundamental na determinação da função gênica

Desafios Diferencialmente dos RNAs e proteínas, é muito difícil estabelecer ligação direta entre genes e metabólitos; Análise é mais complexa; Como um metabólito pode participar de diversas vias metabólicas e os intermediários metabólicos apresentam vida muito curta, a interpretação dos dados metabolômicos é dificultosa.

Análise do Metaboloma Envolve a determinação dos níveis ou concentrações de compostos químicos de baixa massa molecular e que estejam presentes dentro e/ou fora das células. Do ponto de vista analítico, há basicamente duas abordagens principais para a análise do metaboloma: Análise Direcionada: determinação de um grupo de metabólitos pré-definidos, ignorando outros que sejam detectados durante a análise; Perfil Metabólico: conjunto de todos os metabólitos ou produto derivado e que sejam detectáveis durante a análise, acompanhando por uma estimativa de quantidade (absoluta ou relativa).

Preparação das amostras Passo 1: Interrupção rápida do metabolismo (quenching) por alterações na temperatura ou pH. Passo 2: Separação da biomassa celular do meio de cultura; Passo 3: Concentração das amostras, por extração seletiva ou evaporação a vácuo de solventes

Análise dos Metabólitos Métodos mais usados para detecção e análise: Espectrometria de massa Alta sensibilidade e praticidade, possibilidade de se confirmar identidade de componentes e identificação de compostos desconhecidos Ressonância Magnética Nuclear Util na caracterização estrutural de compostos desconhecidos. Mais caro

Metagenômica

definição Metagenômica: é a análise genômica das comunidades de microrganismos de um determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo; Metagenoma: é o genoma coletivo da microbiota total, encontrada em um determinado habitat. Introdução: dificuldade de

Aplicações Saúde humana Microbiomas diferentes entre indivíduos cárie-ativo e indivíduos saudáveis.

APLICAÇÕES Bioenergia A bioprospecção de novas enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas visa a sua utilização na hidrólise da biomassa, para tornar a produção do etanol de segunda geração economicamente viável

APLICAÇÕES Agricultura Identificação de genes altamente resistentes a glifosato a partir de bibliotecas metagenômicas

APLICAÇÕES Biorremediação amplificação de todo o genoma para acessar as populações microbianas em sedimentos contaminados

APLICAÇÕES Metabolismo animal Isolamento e parcial caracterização de novos genes do rúmen de búfalos.

PROJETOS METAGENÔMICOS Identificar genes funcionais e/ou novas vias metabólicas; Estimar a diversidade microbiana; permitindo o estudo dos genomas em uma comunidade como um todo; Compreender a dinâmica da população de uma comunidade inteira.

Desafios de amostragem Amostras devem representar a população → Quantas amostras são necessárias? Curvas de raridade para estimar fração de espécies sequenciadas. (Abundância x Complexidade). Presença de populações dominantes afeta análises → representação maior e maior chance de montar contigs. Quanto mais metadados forem coletados mais detalhadas serão as inferências das condições ambientais. Ex.: dados geográficos, bioquímicos, data de coleta, métodos de extração do DNA. Contigs : é um conjunto de segmentos de DNA que em conjunto representam uma região de consenso de DNA que se sobrepõem.

Métodos tradicionais: Genes marcadores (16S rRNA, recA) Sequenciamento (Sanger, pirosequenciamento) Técnicas de fingerprint (T-RFLP, DGGE) Metagênomica: Melhor representação da composição taxonômica Aspectos funcionais

Necessidade de se obter grande número de sequências Novas plataformas de sequenciamento: 454 (Roche), SOLiD (Applied Biosystems), Genome Analyzer (Illumina) Obtenção de sequências em larga-escala Favorece estudos metagenômicos

PROJETOS ATUAIS Terragenome “Nós sabemos mais sobre o movimento dos corpos celestes do que sobre o solo sob os pés.“Leonardo da Vinci wrote, “We know more about the movement of celestial bodies than about the soil underfoot.” This statement is just as true today, 500 years after it was written, and is particularly applicable to the microorganisms that inhabit the soil as the identities and roles of most of these microorganisms remain a mystery; even the relevance of microbial diversity to the functioning of soils remains obscure. The complete sequencing of a soil metagenome (i.e., the genomes of all microorganisms inhabiting the soil environment) is now an achievable objective that requires a strong international and interdisciplinary collaboration. The purpose of the TerraGenome network is to facilitate activities that will increase our knowledge and understanding of the soil metagenome. “We know more about the movement of celestial bodies than about the soil underfoot.” -Leonardo da Vinci

Projetos atuais Global Ocean Sampling (GOS) Fonte: http://camera.calit2.net/about/gos.shtm

Estudo de caso Genômica funcional de Apis mellifera: busca de novos genes e redes funcionais no contexto do desenvolvimento, da diferenciação de castas e da reprodução

Genoma da Apis mellifera já sequenciado – GenBank;

Análise em larga escala da expressão gênica em diferentes fases do ciclo de vida da abelha; Identificação dos genes envolvidos no: Desenvolvimento de castas Ativação dos ovários em rainhas e operárias Ciclo funcional das glândulas hipofaríngeas Determinação do sexo nas fases iniciais da embriogênese

2 estratégias no projeto:  1) Identificação de genes candidatos no genoma da abelha a partir do conhecimento prévio da função destes genes em outros organismos, especialmente os atributos do Gene Ontology registrados no Flybase

2)  Busca e análise de novos genes através de microarrays, por estratégias de hibridização subtrativa e pela construção de uma biblioteca de cDNA das fases embrionárias. A expressão diferencial destes genes foi avaliada e candidatos de interesse foram investigados com mais detalhe por RT-PCR quantitativa e silenciamento por RNAi. O conjunto das informações geradas foi submetido a análises de redes gênicas para revelar possíveis conexões e a organização em redes funcionais.

Obrigada!