Emprego de marcadores moleculares (RAPD) no estudo genético de Ilex paraguariensis St. Hil. Wendt, S. N.; Mazza, M. C.; Quoirin, M. G.; Sousa, V. A.; Sturion, J. A.

Introdução Ilex paraguariensis Pertence a família Aquifoliaceae Brasil, Paraguai, Argentina e Uruguai Arbórea, 12-30 m, perene (100 anos) Diplóide (2n=40) e dióica (dioicia críptica) Produção de bebidas, corante natural, conservante alimentar, medicamentos diversos, produtos de higiene e cosméticos. Estudos genéticos e programas de melhoramento são escassos  conhecimento da diversidade genética: • planejamento dos programas de melhoramento • conservação de recursos genéticos

Marcadores moleculares Detectam variabilidade genética ao nível de DNA. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Amplificação de segmentos de DNA ao acaso, utilizando um único primer, com 10 pb, cuja sequência nucleotídica é arbitrária O primer dirige a síntese de vários segmentos de DNA em diversos pontos do genoma  várias bandas no gel O polimorfismo tem natureza binária Marcadores genéticos dominantes AA Aa aa

Objetivo Determinar a variabilidade genética de diferentes procedências de erva-mate, utilizando marcadores RAPD.

Materiais e métodos Material vegetal Folhas jovens de três procedências: Ivaí, Pinhão e Cascavel, do teste de procedências e progênies, localizado na Fazenda Vila Nova, Município de Ivaí. 28 indivíduos/procedência. Extração do DNA 150 mg folhas Protocolo modificado de Doyle & Doyle (1987) DOYLE, J.J., DOYLE, J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leal tissue. Phytochem. Bull., v. 9, p. 11-15, 1987.

Etapas da extração do DNA

Quantificação e diluição do DNA Amplificação do DNA Volume final de 13 l. Componentes: DNA, H2O, tampão, MgCl2, dNTPs, primer, Taq polimerase Etapas: - 15 s a 94 ºC - 30 s a 35 - 60 s a 72 ºC - 5 min a 72 ºC 40 ciclos

Eletroforese em gel de agarose 1,6%, corado com brometo de etídeo. 15 primers Primer Sequência (5’  3’) OPA-01 CAGGCCCTTC OPA-02 TGCCGAGCTG OPF-01 ACGCATCCTG OPF-03 CCTGATCACC OPF-05 CCGAATTCCC OPF-14 TGCTGCAGGT OPH-03 AGACGTCCAC OPH-04 GGAAGTCGCC Primer Sequência (5’  3’) OPH-05 AGTCGTCCCC OPH-08 GAAACACCCC OPH-12 ACGCGCATGT OPH-13 GACGCCACAC OPH-15 AATGGCGCAG OPH-18 GAATCGGCCA OPH-19 CTGACCAGCC Eletroforese em gel de agarose 1,6%, corado com brometo de etídeo. Os géis foram visualizados em transiluminador de luz UV e fotografados.

Etapas da técnica RAPD

Resultados Análise dos dados Os fragmentos foram tabulados como 1 para presença e 0 para ausência de banda no gel de eletroforese. Resultados Perfil RAPD Os 15 primers produziram 159 fragmentos, com o número de bandas produzidas por primer variando de 6 (OPH-19) até 13 (OPH-05), em média 10,6 bandas/primer. 71,40% fragmentos polimórficos. O tamanho dos fragmentos variaram de 110 a 1830 pb.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 M Produtos da amplificação por RAPD de amostras da procedência Pinhão, usando o primer OPH-12. M = DNA Ladder 100 pb, 1-28 = Indivíduos da procedência Pinhão, Colombo-PR, 2001.