PCR Polymerase Chain Reaction

Apresentação em tema: "PCR Polymerase Chain Reaction"— Transcrição da apresentação:

1 PCR Polymerase Chain Reaction
Amplificação in vitro de uma seqüência específica de DNA * replicação in vitro

2 HISTÓRIA DA PCR Kary Mullis (1983) Prêmio Nobel Química (1993)
Revolucionou genética pesquisa genética medicina forense genética molecular

3 ETAPAS DA REAÇÃO Ocorre em 3 etapas: a) “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), b) “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado), c) “extension” (extensão ou seja a polimerização propriamente dita)

4 COMPONENTES DA REAÇÃO DNA molde Oligonucleotídeos (primer) dNTP’s
DNA Polimerase Magnésio Tampão Água

5 Temperatura Ótima: 72 graus
DNA POLIMERASE Thermus aquaticus -Estável a temperaturas de 177 graus; Temperatura Ótima: 72 graus

6 Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park”
de onde foi isolado o Thermus aquaticus

7 EQUIPAMENTO TERMOCICLADOR

8 Reação em Cadeia da Polimerase
PCR Reação em Cadeia da Polimerase PCR se constitui hoje no método de rotina para isolar rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura complexa de seqüências genômicas ou de cDNAs.

9 CICLOS DA PCR PCR Programa 35 ciclos 94 0C por 5 min 94 0C por 1 min

10 O ciclo da PCR

11 Análise dos Resultados
Extração de DNA Desenho dos Primers Reação de PCR Análise dos Resultados ETAPAS

12 EXTRAÇÃO DO DNA

13 DELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos / primers) são a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR. -Tamanho dos primers; - Estabelecimento das temperaturas corretas a serem utilizadas; National Center for Biotechnology Information

14 ANELAMENTO E POLIMERIZAÇÃO

15 ETAPAS DA PCR

16 ETAPAS DA PCR DESNATURAÇÃO ANELAMENTO POLIMERIZAÇÃO

17

18

19 ELETROFORESE

20 ELETROFORESE

21 VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA

22 RESULTADOS Eletroforese do DNA em gel de agarose 0.8%

23 RESULTADOS

24 APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR
Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas Amplificação de genes para posterior clonagem e expressão Determinação de variabilidade genética Deteção de OGMs Sexagem de embriões Estudo da expressão gênica

25 APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR
Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo circular Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

26 APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata Trio Normal (sup. Pai, mãe e criança) R$ 600,00 Visualização do Gel em Paternidade Comprovada para um "loci" estudado