Aula 1- Laboratório e Cultura de células Imunologia – CFA 3º Aula 1- Laboratório e Cultura de células

Riscos associados ao trabalho laboratorial em imunologia Risco químico Consideram-se agentes de risco químico as substâncias, compostas ou produtos que possam penetrar no organismo pela via respiratória, nas formas de poeiras, fumos, névoas, neblinas, gases ou vapores, ou que, pela natureza da actividade de exposição, possam ter contato ou ser absorvido pelo organismo através da pele ou por ingestão Risco radiológico Radioactividade. Ao contrário dos outros reagentes químicos, os compostos radioactivos não podem ser vistos e são isentos de cheiro, não se manifestando os seus efeitos no imediato. Risco biológico Consideram-se agentes de risco biológico as bactérias, fungos, parasitas, vírus, entre outros. Todas as amostras de produtos biológicos devem ser consideradas potencialmente infecciosas

Procedimentos de segurança Risco químico Uso de bata, luvas e óculos; trabalho em hotte; verificar os rótulos dos produtos utilizados. Risco radiológico Regras de manipulação específicas. Procedimentos particulares para a eliminação dos resíduos e monitorização das pessoas e ambientes envolvidos.

Risco biológico Os agentes de risco biológico podem ser distribuídos em quatro classes de 1 a 4 por ordem crescente de risco, classificados segundo os seguintes critérios: Patogenicidade para o homem Virulência Modos de transmissão Disponibilidade de medidas profiláticas eficazes Disponibilidade de tratamento eficaz Endemicidade

Risco biológico Classe de Risco I - Escasso risco individual e comunitário. O Microrganismo tem pouca probabilidade de provocar enfermidades humanas ou enfermidades de importância veterinária.Ex.:Bacillus subtilis Classe de Risco II - Risco individual moderado, risco comunitário limitado. A exposição ao agente patogénico pode provocar infecção, porém, se se dispõe de medidas eficazes de tratamento e prevenção, o risco de propagação é limitado. Ex.:Schistosoma mansoni Classe de Risco III - Risco individual elevado, baixo risco comunitário. O agente patogênico pode provocar enfermidades humanas graves, podendo propagar-se de uma pessoa infectada para outra, entretanto, existe profilaxia e/ou tratamento. Ex.:Mycobacterium tuberculosis Classe de Risco IV - Elevado risco individual e comunitário. Os agentes patogênicos representam grande ameaça para as pessoas e animais, com fácil propagação de um indivíduo para outro, directa ou indirectamente, não existindo profilaxia nem tratamento. Ex.:Vírus Ebola

Métodos de controle de agentes de risco Recomendações gerais Nunca pipetar com a boca, nem mesmo água destilada. Usar dispositivos de pipetagem mecânica. Não comer, beber, fumar, masquar chiclas ou utilizar cosméticos no laboratório. Evitar o hábito de levar as mãos à boca, nariz, olhos, rosto ou cabelo, no laboratório. Lavar as mãos antes de iniciar o trabalho e após a manipulação de agentes químicos, material infeccioso e animais, mesmo que se tenha usado luvas de protecção, bem como antes de deixar o laboratório. Objectos de uso pessoal não devem ser guardados no laboratório. Utilizar um uniforme protector, de algodão, apenas dentro do laboratório. Não utilizar essa roupa fora do laboratório. Utilizar luvas aquando o manuseamento de material infeccioso e animais. Não usar jóias ou outros adornos nas mãos, porque podem impedir uma boa limpeza das mesmas. Manter a porta do laboratório fechada. Deve-se restringir o acesso do mesmo. Não manter plantas, bolsas, roupas ou qualquer outro objecto não relacionado com o trabalho dentro do laboratório.

Resíduos Infectantes MATERIAL PROVENIENTE DE ÁREAS DE ISOLAMENTO   MATERIAL BIOLÓGICO   SANGUE HUMANO E HEMODERIVADOS RESÍDUOS CIRÚRGICOS E ANÁTOMO-PATOLÓGICOS

Procedimentos recomendados para o descarte A disposição inadequada dos resíduos gerados em laboratório poderá constituir focos de doenças infecto-contagiosas se, não forem observados os procedimentos para seu tratamento. O lixo contaminado deve ser embalado em sacos plásticos para o lixo tipo 1 Todos os utensílios que entrarem em contacto directo com o material deverão passar por desinfecção posterior. Os sacos plásticos deverão ser identificados com o nome do laboratório de origem, sala, técnico responsável e data do descarte. Autoclavar a 121ºC (125F), pressão de 1 atmosfera (101kPa, 151 lb/in acima da pressão atmosférica) durante pelo menos 20 minutos.

CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS  O que é?  Qual o objectivo?  Como se processa?

 O que é? Cultura in vitro de células (desde 1900)  Qual o objectivo? Na investigação Substituição de modelos animais Produção de citoquinas Vias de transdução de sinal Requisitos de factores de crescimento

Propósitos comerciais Culturas em grande escala Na clínica Cultura de órgãos Cultura de tipos particulares de células (macrofagos, fibroblastos; células dendríticas, linfócitos) Estudo da competência proliferativa

Cultura de órgãos Cultura tridimensional de um tecido não desagregado que mantém a maioria ou todas as características histológicas do tecido in vivo Culturas Histotípicas As células são reassociadas de forma a criar uma estrutura 3D semelhante ao tecido original (infiltração de uma matriz de colagéneo em gel)

APLICAÇÕES Estudos imunológicos Resposta celular in vitro Migração celular Estudos de sensibilidade a drogas Citotoxicidade Adesão celular Proliferação celular

Estudos microbiológicos Estudos Oncológicos - Estudos de sensibilidade a drogas Adesão celular Quimiotaxia Estudos microbiológicos Quimioterapia (resistência a químicos) Fagocitose Estudos Moleculares - Clonagem de genes - estudo da expressão e função Estudos em células estaminais - Processo de diferenciação, cirurgia reconstrutiva

É necessário mimetizar as condições fisiológicas Células ou tecidos  Como se processa? É necessário mimetizar as condições fisiológicas Células ou tecidos Equipamento Incubador de CO2 Armazenamento em N2 líquido Câmara de fluxo laminar Microscópio Hemocitómetro Técnica asséptica Soluções filtradas

numa cultura em “vias de extinção”... Não foram feitos triplicados Não foi considerada a presença de activadores (proliferação, activação, etc) Não foi conseguida uma população homogénea Foi contaminada over crowd ... Grande azelha!!

Meio de cultura apropriado: - Factores de crescimento Requisitos das culturas celulares Meio de cultura apropriado: - Soro e nutrientes - Factores de crescimento Antibióticos Atmosfera adequada Superfície de adesão

Meio de cultura apropriado SORO e NUTRIENTES Soro, a parte não celular do sangue, contém centenas de proteínas e factores necessários ao crescimento celular: - Insulina, Transferrina e Proteínas transportadoras de ferro; Factores de crescimento Vitaminas Biotina, Folatos, Tiamina, riboflavina, ácido pantoténico,etc Sais NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 Glucose

Nutrientes: - Aminoácidos essenciais: Histidina Leucina Lisina Metionina Valina - Aminoácidos não essenciais: Cisteína Glutamina Tirosina Isoleucina Fenilalanina Treonina Triptofano

LPS e os superantigéneos Factores/Estimuladores de Crescimento GM -CSF Interleucinas PHA - linfócitos T IL2 – linfócitos T Eritropoitina – glóbulos vermelhos PWM – linfócitos B Concavalina A – linfócitos T LPS e os superantigéneos

- Penicilina (inibe gram +) Streptomicina (inibe gram -) Antibióticos - Penicilina (inibe gram +) Streptomicina (inibe gram -) Amfotiricina (inibe fungos) mercaptoetanol O pH varia com o tipo de célula: maioria: 7.4 linhas de fibroblastos 7.4 - 7.7 células epidermicas 5.5 Vermelho de fenol (indicador do pH do meio)

As células animais normais não crescem em suspensão Superfície de adesão No organismo, as células contactam e interagem especificamente com outras células e com a matriz extracelular Matriz extracelular Rede de proteínas (fibrosas) e carbohidratos, secretados pelas células (a constituição exacta depende da função do tecido) Preenche os espaços entre as células Permite que os tecidos se mantenham coesos As células animais normais não crescem em suspensão

 Algumas células tumorais crescem em suspensão CULTURA SUPORTE Tipo de placa utilizada: Vidro Plástico (poliestireno, PVC, Teflon, PTX) especialmente tratado de forma a melhorar a adesão das células (carregado negativamente com SO3- poli lisina, dextrano, colagéneo, gelatina, fibronectina) As células em cultura secretam colagéneo e outros componentes da matriz extracelular que se ligam ao suporte  Algumas células tumorais crescem em suspensão

Culturas primárias Derivam directamente dos tecidos ou orgãos (pele, rim, fígado) Estes devem ser obtidos em condições assépticas e levados ao laboratório rapidamente, imersos em meio de cultura, para manutenção da viabilidade celular. Constituídas por células diplóides Desvantagens: difícil obtenção, custo elevado, degeneração rápida (2 gerações) Vantagens: muito sensíveis para o cultivo de vírus, usadas na produção de vacinas Ponto de partida para linhas celulares

Preparação de Culturas Primárias Ex: obtenção de culturas primárias a partir de medula óssea (Mθ e/ou DC) 1- Remover femures de ratinho cirurgicamente com tesoura e forceps esterelizados. 2-Usando uma seringa de 5 ml, com meio de cultura, inserir a agulha no fémur e expelir as células da medula ósses, para uma placa de cultura. 3- Lavar as células usando centrifugação- decantar o sobrenadante (granulócitos) e retirar o sedimento contendo as restantes células. 3-Ressuspender as células em meio de cultura apropriado por 3 dias. 4-Ao quarto dia trasnferir as células em suspensão para novas placas de cultura com meio fresco.: .as células aderentes-Macrófagos e monócitos .as células semi-aderentes em suspensão-DC a pureza das células dendriticas é medida por FACS uasndo anticorpo anti-CD11c 5- Colocar as células em incubadora a 37ºC e observar diariamente)

Linhas celulares resultam da selecção, de culturas primárias, de clones capazes de sobreviver e de se multiplicar indefinidamente (50 gerações) estes clones (qq população de células descendentes de uma célula única ancestral) originam linhas celulares diplóides ou aneuplóides Linhas diplóides: mais de 75% das células são diplóides; resistem a 30-50 gerações; são sensíveis para o isolamento de vírus; podem ser usadas na preparação de vacinas Linhas aneuplóides ou linhas contínuas: Contém um cariótipo aneuplóide (nº de cromossomas2n); podem derivar de tecidos neoplásicos ou de células normais mutadas; úteis para diagnóstico, isolamento e propagação de vírus

Fase I: proliferação de fibroblastos Fase II: taxa de crescimento constante Fase III:período de morte celular os fibroblastos são o tipo de células predominente e morrem ao fim de 50 gerações. Se se partir de 106 células podem-se obeter mais de 1050 células

Hibridoma: Híbrido de células tumorais e normais Linhas Celulares Imortais Têm origem em células tumorais, que sofreram transformações oncogénicas. Não só crescem indefinidamente em cultura, mas também o fazem máis rapidamente, duplicando o seu nº em menos de 24 horas. Apesar da sua proveniência tumoral mantem as propriedades básicas celulares, o que permite ao imunologista a transferência de genes no intuito de investigar a sua função e regulação. Ex: Infecção por vírus - HTLV-1 - para células T - EBV - para células B Hibridoma: Híbrido de células tumorais e normais

Método Directo mais comum de passagem de culturas Passagem de células saudáveis (>90% viabilidade) do meio inicial para um meio fresco, de concentração decrescente de soro. A subcultura é feita sempre que haja 90-100% confluência, 106 Repicagem com hansa ou pelo uso de tripsina

Assepticamente, retirar duas amostras das células em cultura (0.5ml) Contagem de células Assepticamente, retirar duas amostras das células em cultura (0.5ml) misturar as células em azul de tripano (0.04%) depois de coradas, determinar o nº de células viáveis usando um hemocitometro (câmara de contagem) e microscópio

Testes para detecção da infecção pelo HIV Técnicas de cultura viral Cultura de células mononucleares de sangue periférico para isolamento do HIV Esta técnica foi inicialmente utilizada para caracterizar o HIV como agente causador da SIDA. As culturas são observadas quanto à evidência de formação de células gigantes multinucleadas, presença de maarcadores: actividade da transcriptase reversa e produção de antígeno p24 no sobrenadante. São consideradas positivas quando dois testes consecutivos detectam a presença dos parâmetros acima descritos em valores superiores ao limite de corte (cut-off).

Bancos de células São populações de linhas celulares disponíveis comercialmente É conhecido o método de isolamento e produção Existe um controlo de qualidade permanente (contaminação e genotipagem) Ex: THp1, CHO, tsDC, ...