Produção de proteínas em bactérias 3/25/2017 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Produção de proteínas em bactérias Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br 06 de abril de 2010 1

Proteína recombinante DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes. Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Pneumonia Micoplásmica Suína Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

Sistemas de expressão heteróloga ***Animais e plantas

Produção de proteínas recombinantes em bactérias Escherichia coli Bacillus subtilis Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

Engenharia genética X expressão heteróloga 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparo do vetor 3. Ligação do vetor com o “inserto” 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

Vetores de Expressão Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG Sítio de múltipla clonagem (polylinker) Promotores induzíveis (controle da expressão) Sinais de secreção Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação)

Vetor de expressão em E. coli RBS ou sequência de Shine Dalgarno

Regulação da expressão gênica – controle da expressão Operon Lac

Vetores da família pET (Novagen) Altos níveis de expressão Promotor T7 é mais forte que o lac Controle rigoroso pelo lacO Necessita de cepa de E. coli especial – BL21(DE3) IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

Proteína recombinante de 70 kDa Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE não induzidas Proteína recombinante de 70 kDa induzidas com IPTG

Produção de proteínas recombinantes em bactérias (sistema pET)

Vetor de expressão com cauda de histidina

Cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose Purificação de proteínas com cauda de histidina (his-tag)

Minimizar a proteólise Maximizar a expressão Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) Facilitar o folding Solubilidade

Algumas companhias que comercializam vetores de expressão http://www.promega.com http://www.neb.com http://www.stratagene.com http://www.invitrogen.com

Produção de insulina recombinante (Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation) Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos; Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais; Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes. Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana Seq sinal Cadeia β Peptídeo C Cadeia α Preproinsulina Clivagem da sequência sinal de secreção Cadeia α Cadeia β Peptídeo C Cadeia α Ligações dissulfeto Proinsulina Cadeia β Clivagem do peptídeo C Insulina funcinal

Obtenção de insulina recombinante

Algumas proteínas recombinantes disponíveis para terapia humana Insulina (rhI); Hormônio do crescimento (rhGH); Hormônio folículo estimulante (rhFSH); Fator VIII (rhFactorVIII); Eritropoetina (EPO); Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF); N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB); DNAse Ativador do plasminogênio tecidual (rhTPA); Glicocerebrosidase (rhGBA); Interferon-alfa, -beta e gama (rhIFN-alpha, -beta e -gama); Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).

Vantagens e desvantagens do sistema de expressão heteróloga em E. coli Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

Trabalho complementar * Formar grupos com 4 componentes * Buscar no PubMed artigo científico relacionado a expressão de proteína heteróloga em E. coli * Entregar até 12-04-10 - Referência bibliográfica - Descrição da proteína recombinante - Aplicação da proteína recombinante - Vetor utilizado para a expressão - Características do vetor de expressão - Estratégia de purificação da proteína recombinante - Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante