Produção de proteínas recombinantes em microrganismos 3/25/2017 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Produção de proteínas recombinantes em microrganismos Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br 05 de abril de 2011 1

Proteína recombinante DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes. Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Pneumonia Micoplásmica Suína Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

Enterite necrótica das aves Clostridium sp. Botulismo Enterite necrótica das aves Toxina botulínica Enterite suína

Sistemas de expressão heteróloga ***Animais e plantas

Produção de proteínas recombinantes em bactérias Escherichia coli Bacillus subtilis Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

Relação volume meio – capacidade do frasco 0,2 (20%) Inóculo – 5 a 10%

Algumas companhias que comercializam vetores de expressão http://www.promega.com http://www.neb.com http://www.stratagene.com http://www.invitrogen.com

Expressão heteróloga em E. coli Vantagens Desvantagens Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

*** Alternativas

Minimizar a proteólise Maximizar a expressão Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) Facilitar o folding Solubilidade

Expressão heteróloga em B. subtilis Vantagens Desvantagens Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares Codon usage adequado Plasmídeos instáveis Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas Alta produção de proteínas heterólogas *** Alternativas

Leveduras Multiplicação rápida Manipulação simplificada Altas densidades celulares Unicelulares Não Patogênicas (GRAS) Fisiologia e genética bem conhecida Realiza modificações pós-traducionais Promotores “fortes” (constitutivos ou induzíveis)

Principais espécies utilizadas Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

Saccharomyces cerevisiae

Desvantagens Saccharomyces cerevisiae Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose Alteração da antigenicidade da proteína Alteração da estrutura 3D Produção de Etanol – tóxico Falha na secreção de proteínas Alternativa: outras espécies de leveduras

Proteínas expressas Vacinas Antígeno do vírus da Hepatite B (1986) Proteína de envelope do HIV-1 Diagnóstico Proteína do vírus da Hepatite C Antígenos do HIV-1 Agentes terapêuticos humanos Insulina GM-CSF Fator de crescimento Soro albumina humana

Pichia pastoris Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades celulares Alta produtividade: até 12g de proteína recombinante por litro de cultivo!

Pichia pastoris

Pichia pastoris Desvantagens Proteólise de proteínas secretadas Poucos vetores disponíveis (Invitrogen) Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de oxigênio!

Metabolismo do Metanol Álcool Oxidase Dois genes: AOX1 e AOX2 AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de metanol Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)

Metabolismo do Metanol

Metabolismo do Metanol Vantagem Fonte de carbono de custo reduzido Só passa a ser utilizado quando já há alta densidade celular Desvantagem Inflamável e tóxico Controle rígido dos níveis de oxigênio (~30%)

Fenótipos Mut = Metanol Utilization Mut+ - crescimento rápido em metanol MutS – crescimento lento em metanol

Cepas

CLONAGEM - INTEGRAÇÃO

Proteínas expressas em Pichia