ANÁLISES DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS

Histórico dos Estudos em Cromossomos Fim Século XIX 1º idéias cromossomos: estudos mitose (divisão celular). Flemming (1882) termo mitose, divisão mitótica foi mais bem estudada em animais e vegetais. Weismann (1887) a partir de seus trabalho, relação com a herança Redescobrimento das leis de Mendel (1900), “Teoria cromossômica da herança” por Sutton e Boveri em 1902. Conseqüência: citologia e a genética sobrepõem seus conhecimentos na área denominada CITOGENÉTICA.

CITOGENÉTICA: compreende todo e qualquer estudo relativo ao cromossomo isolado ou em conjunto, condensado ou distendido, tanto no que diz respeito a sua morfologia, organização, função e replicação, quanto a sua variação e evolução. (Guerra, 1988)

Análise de Cromossomos Células em divisão → Mitose Metáfase → cromossomos com grau máximo de condensação Tecidos de crescimento rápido → sangue, medula óssea, rins, etc.

Técnica de Obtenção de Cromossomos Obtenção Direta → extração do tecido Obtenção Indireta → cultura de células

TÉCNICA IN VITRO: Cultura de linfócitos

Coleta do sangue Hemáceas - Separação do sangue em 3 fases: Papa leucocitária Região Líquida

- Aplicar a papa leucocitária Sangue semeado no meio de cultura - Aplicar a papa leucocitária - Meio de cultura contendo fitohemaglutinina - Estimula crescimento de linfócitos T

3 dias de crescimento em estufa a 37ºC Estímula divisão celular Meio + sangue na estufa 3 dias de crescimento em estufa a 37ºC Estímula divisão celular

Aplicação de Colchicina: “Antimitótico” Impede ligação do fuso mitótico Célula não sofre divisão Aplicação de Solução Hipotônica: Osmose Aumenta tamanho da célula Mais fácil de espalhar e visualizar o material Material na estufa 37oC

Preparo do material para Fixação: Solução de álcool + ácido acético = FIXADOR Limpa o material Fixa a célula na fase desejada Preparo do material para centrifugação

Montagem de Cariótipos Cariótipo – grego = cerne (conteúdo do núcleo) Disposição dos cromossomos recortados Ordem Tamanho Formato dos cromossomos a m st sm

Formato dos Cromossomos Braço curto (p) Francês - petite Centrômero Braço longo (q) Letra seguinte do alfabeto

Classificação dos Cromossomos Razão de braços – q/p TIPO CROMOSSÔMICO RAZÃO DE BRAÇOS Metacêntrico (m) RB = 1,00 – 1,70 Submetacêntrico (sm) RB = 1,71 – 3,00 Acrocêntrico (a) RB = 3,01 – 7,00 Telocêntrico (t) RB > 7,01

Classificação dos Cromossomos - Metacêntrico: possui braços aproximadamente do mesmo tamanho; - Submetacêntrico: possui um dos braços menor que o outro; - Acrocêntrico: possui um dos braços muito pequeno em relação ao outro; - Telocêntrico: possui apenas um braço, pois o centrômero se localiza na extremidade do filamento do cromossomo.

Sapo: 2n = 26 Avestruz : 2n= 22

Peixe : 2n = 56 Vegetal 2n = 16

Cariótipo Humano

Grupo A: (cromossomos 1, 2 e 3), meta e submetacêntricos Grupo B: (cromossomos 4 e 5), submetacêntricos Grupo C: (cromossomos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e cromossomo  X), submetacêntricos Grupo D: (cromossomos 13, 14 e 15), acrocêntricos Grupo E: (cromossomos 16, 17 e 18) submetacêntricos Grupo F: (cromossomos 19 e 20), metacêntricos Grupo G: (cromossomos 21, 22 e cromossomo Y), acrocêntricos

BANDAMENTOS CROMOSSÔMICOS

Qual a importância dos bandamentos cromossômicos? • Os bandamentos cromossômicos ampliaram em muito os horizontes da citogenética, sendo primeiramente utilizados para auxiliar no pareamento. • Em um segundo momento, as diferentes técnicas de bandamento passaram a auxiliar na detecção de rearranjos (duplicações, deleções, inversões, translocações) que dificilmente seriam detectados com a técnica convencional. Por exemplo: Humano: identificar alterações entre cromossomos do grupo D distinguir a trissomia do 21 da trissomia do 22 - Evolução: Cariótipo Humano X Primatas (chimpanzé, gorila e orangotango)

• Bandamento NOR • Bandamento – C • Bandamento – G • Bandamento – R • Bandamento – Q

Colocação Convencional por Giemsa Gustav Giemsa Tipo de coloração mais comum Não é intercalante de DNA, cora na sua totalidade Técnica utilizada para visualizar forma e número de cromossomos

Genes Housekeeping X Genes Tecido-específicos Bandamento - G Corante Giemsa - Essa técnica é a mais utilizada entre os bandamentos Permite visualizar as regiões que se condensam mais cedo durante a prófase (regiões escuras) e possuem uma constituição AT-rica, enquanto os segmentos negativos para banda-G (regiões claras) são condensados tardiamente na prófase e são ricos em bases GC. Genes Housekeeping X Genes Tecido-específicos

Cariótipo G – bandado

Banda G - morcego

Bandamento - Q Essa foi a primeira técnica de bandeamento, a qual foi descrita por Caspersson et al. (1968) para cromossomos humanos Essa técnica utiliza corantes fluorescentes para induzir o bandeamento O primeiro fluorocromo utilizado foi a quinacrina mostarda, o qual deu o nome para a técnica O padrão de bandas – Q está relacionado ao padrão de replicação do DNA - SEMICONSERVATIVO

Cariótipo Q – bandado

Bandamento - R Também conhecido por Banda Reversa Esse bandeamento ocorre devido ao tratamento do material em alta temperatura, o que induz a desnaturação de proteínas e do DNA de constituição AT-rica, mantendo o DNA GC-rico com a configuração original O padrão de bandamento é revelado devido a maior interação do corante às regiões desnaturadas (AT-rica) Pode ocorrer a utilização tanto de corantes fluorocromos (acridina laranja) como de convencional (Giemsa)

Bandamento - NOR As regiões cromossômicas associadas ao nucléolo. Cada organizador nucleolar corresponde a um agrupamento de genes de rRNA repetidos em tandem em um cromossomo. A concentração dos genes de rRNAs em tandem, juntamente com a transcrição intensiva dos mesmos, são responsáveis pela criação da morfologia característica dos nucléolos

Impregnação pelo nitrato de prata - Humano RONs: impregnação pelo nitrato de prata, não é específico ao DNAr, mas às proteínas acídicas (pré-rRNA) Atividade gênica Impregnação pelo nitrato de prata - Humano

RON - Morcego RON - roedor

Banda C de cariótipo humano Bandamento - C Este tipo de Bandamento mexe com a estrutura dos cromossomos, devido a uma série de banhos que são feitos na lâmina. O padrão de bandas evidencia as regiões de heterocromatina constitutiva presente na espécie. Banda C de cariótipo humano

Cariótipos de Astyanax fasciatus submetido ao bandamento C

Eyprepocnemis plorans – gafanhoto (DAPI) Fluorocromos Corantes fluorescentes. Corantes podem marcar regiões específicas; utilizar sondas específicas, etc. Visualizados em comprimentos de onda específicos. Eyprepocnemis plorans – gafanhoto (DAPI)

Rineloricaria latirostris – 12 cm CromomicinaA3 DAPI Rineloricaria latirostris – 12 cm

Sonda Telomérica em humanos