INTRODUÇÃO Bacteriófagos são agentes virais que infectam bactérias. São amplamente distribuídos na natureza, e sugere-se que tenham papel importante nas dinâmicas das populações microbianas (3,4). A propriedade lítica destes agentes constitui uma importante ferramenta para o microbiologista, aplicada na detecção e identificação bacteriana (2), em análises epidemiológicas (7) e, conforme reavaliado em estudos recentes, com grande potencial no controle biológico de bactérias relacionadas a enfermidades em plantas (6), animais e homem (1,4,8). OBJETIVO Isolar bacteriófagos com atividade lítica em bactérias de importância em medicina veterinária: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter spp., Proteus mirabilis, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. ISOLAMENTO DE BACTERIÓFAGOS COM ATIVIDADE LÍTICA EM BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA VETERINÁRIA Asanome, W. 1 ; Pereira, C.R. 1 ; Gomes, M.J.P. 2 1 Acadêmicos, FAVET, UFRGS. 2 Professor do Departamento de Patologia Clínica Veterinária, FAVET, UFRGS. RESULTADOS E DISCUSSÃO Com uma metodologia relativamente simples, foi possível isolar bacteriófagos com atividade lítica em Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter spp. (Quadro 1 e Figura 2). Estudos específicos sobre os bacteriófagos isolados (caracterização genética, morfológica e das interações com as respectivas bactérias hospedeiras) fornecerão embasamento para a avaliação do seu potencial como ferramenta em detecção e identificação bacteriana, em análises epidemiológicas, e como agentes de controle biológico. Das possibilidades citadas, destacamos a última, cuja abordagem tem atraído um número crescente de pesquisas nos últimos anos, devido principalmente à emergência de bactérias com resistência múltipla a antimicrobianos. REFERÊNCIAS 1. CARLTON, R. M. Phage Therapy: Past History and Future Prospects. Archivum Immunologiae et Therapie Experimentalis. v.47, p , jun FAVRIN, S. J.; JASSIM, S. A.; GRIFFITHS, M. W. Development and Optimization of a Novel Immunomagnetic Separation-Bacteriophage Assay for Detection of Salmonella enterica Serovar Enteritidis in Broth. Applied and Environmental Microbiology. v.67, n. 1, p , jan HENNES, Kilian P.; SIMON, M. Significance of Bacteriophages for Controlling Bacterioplankton Growth in a Mesotrophic Lake. Applied and Environmental Microbiology. v. 61, n. 1, p , jan NAKAI, T; PARK, S. C. Bacteriophage Therapy of Infectious Diseases in Aquaculture. Research in Microbiology. v. 153, p , ROVOZZO, G.C.; BURKE, C.N. A Manual of Basic Virological Techniques. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, 1973, 272 p. 6. SCHNABEL, E. L.; JONES, A. L. Isolation and Characterization of Five Erwinia amylovora Bacteriophages and Assessment of Phage Resistance in Strains of Erwinia amylovora. Applied and Environmental Microbiology. v. 67, n. 1, p , jan SANTOS, L. R.; NASCIMENTO, V.P.; OLIVEIRA, S.D.; RODRIGUES, D.P.; REIS, E.M.F.; SEKI, L.M.; RIBEIRO, A.R. & FERNANDES, S.A. Phage Types of Salmonella Enteritidis Isolated from Clinical and Food Samples, and from Broiler Carcasses in Southern Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. v. 45, n. 1, p. 1-4, jan-feb SULAKVELIDZE, A.; ALAVIDZE, Z.; MORRIS JR., G. Bacteriophage Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. v.45, n.3, p , mar Quadro 1. Bacteriófagos isolados: fontes e morfologia de placa Figura 2. Plaqueamentos em dupla camada de ágar. a) Fago Ec 01; b) Fago Ec 02; c) Fago Ec 03; d) Fago Ec 04; e) Fago Pa 01; f) Fago Pa 02; g) Fago Pa 03; h) Fago Pa 04. Figura 1. Fluxograma da metodologia de isolamento e purificação de placa MATERIAIS E MÉTODOS Culturas bacterianas. Para todas as etapas do experimento, foram utilizados cultivos das cepas bacterianas em caldo triptose, em crescimento exponencial, com concentração aproximada de 3x10 8 UFC.ml -1. Amostras para isolamento. As amostras constituíram-se de dejetos de animais em confinamento (local de colheita denominado CFV), de esgoto urbano puro (local Gr) e de águas de coleções que recebem esgoto sem tratamento (locais CV e AD). Foram colhidas amostras com volumes entre 200 e 1000 ml. Isolamento e purificação de placa. Para o isolamento dos bacteriófagos foi utilizada a técnica do enriquecimento (5). As amostras colhidas foram enriquecidas individualmente em culturas das bactérias-alvo por um período mínimo de 24 horas, a 37°C. A seguir, foram centrifugadas (1400 x g por 10min.), filtradas (membrana com poro de tamanho 0,45 μm) e inoculadas em culturas indicadoras. Os cultivos foram avaliados para atividade lítica após 24 horas de incubação a 37°C. Os filtrados que originaram cultivos líquidos com clareamento e/ou cultivos em placa com áreas sem crescimento foram submetidos a diluições seriadas e plaqueados em dupla camada de ágar pelo método padrão (5). Os filtrados definitivos foram obtidos após três ciclos de purificação de placa lítica isolada e conservados a 6-7°C. Os procedimentos de isolamento e de purificação de placa estão esquematizados na figura 1. Bacteriófago Cepa Hospedeira Características de placa lítica Fonte de isolamento DiâmetroAspecto Pa 01P. aeruginosa 113/ mmClara Local CFV Pa 02P. aeruginosa 113/ mmClara Local CV Pa 03P. aeruginosa 113/ mmClara Local AD Pa 04P. aeruginosa 113/ mmClara Local Gr Ec 01E. coli O157:H7 099/ mmClara Local CFV Ec 02E. coli O157:H7 100/ mmTúrbida Local CFV Ec 03E. coli O157:H7 101/ mmClara Local CFV Ec 04E. coli O157:H7 102/ mmClara Local CFV Kp 01K. pneumoniae 064/ Local CFV C 01Citrobacter spp. 181/ Local CFV abcd efgh Solidificação; incubação a 37°C por 24h Recorte de placa lítica isolada Suspensão em caldo triptose Agitação por 10’ Filtração Despejamento sobre ágar sólido 1,5% Repouso a 6-7°C por 4h para difusão viral 2. Purificação de placa lítica Filtrado diluído (0,1ml) Cultivo bacteriano (0,1ml) Ágar semi-sólido 0,75% derretido (3ml, 50°C) Adsorção viral (37°C, 15’) Homogeneização Incubação a 37°C, 24h Inoculação em cultura indicadora Tubo controle (túrbido) Tubo teste (clareamento) Incubação a 37°C, 24h Avaliação de atividade lítica Áreas sem crescimento nos pontos de inoculação Centrifugação a 1400 x g por 10’ Enriquecimento da amostra Cultivo bacteriano + Caldo 10x concentrado + Amostra p/ isolamento (Proporção 1:1:9) Filtração (membrana com poro tamanho 0,45 μm) 1. Isolamento