Alvaro Moreno Junior Karina Hoshino Simone Mariko Siguematu.

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1 Alvaro Moreno Junior Karina Hoshino Simone Mariko Siguematu

2  Escherichia coli causador de diarréia em humanos é conhecido como DEC (Diarrheagenic E. coli) e é dividido em 6 grupos:  STEC: E coli produtora de toxina Shiga  ETEC: E coli enterotoxigênica  EPEC: E coli enteropatogênica  EIEC: E coli enteroinvasiva  EAggEC: E coli enteroagregativa  DAEC: E coli que se adere difusamente

3  As DECs têm mecanismos de virulência diferentes: produção de toxinas, habilidade de invasão a célula alvo.  A identificação desses 6 grupos de DECs é muito complexa, demanda tempo, tem um alto custo e os laboratórios clínicos rotineiramente utilizam apenas a sorotipagem para o teste de identificação.  Os genes relacionados a patogenicidade do DAEC ainda não foram identificados.

4  Dentre as várias técnicas de identificação desenvolvidas, o mais útil é o mPCR.  Vários estudos comprovaram o seu emprego em identificação de genes alvo, genes virulentos.  Neste estudo, foi selecionado um conjunto de primers cujos amplicons poderiam ser identificados facilmente e em um tamanho adequado.  9 genes alvo: stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, STh gene, STp gene, LT gene e astA

5  Até o momento não se conseguiu detectar os nove alvos e um único ensaio de mPCR. Por isso, o estudo foi realizado em dois ensaios simultâneos.  No ensaio 1, foi usado um conjunto de 5 primers ( stx 1, eaeA, invE, STp gene e astA ). No ensaio 2 conjunto de 4 primers ( stx 2, aggR, STh gene e LT gene). Estes dois ensaios foram realizados simultaneamente em cada um dos 2 tubos de reação.

6 Cepa bacteriana e modelo de preparação de DNA - Foi usado um total de 7 cepas controle (Tabela 1), todos foram incubados em Agar Kajiton a 37 °C por 20 ± 2 h e armazenado a 4 °C.

7  Cepa bacteriana e modelo de preparação de DNA - Para a extração de DNA, cada controle foi crecido em 30 mL de caldo de Luria-Bertani com agitação a 37 °C overnight. - 100 µL da cultura de bactéria foi suspenso em 900 µL de tampão Tris-EDTA, fervido por 5 min e centrifugado a 10.000 x g por 5 min - O sobrenadante foi usado como o modelo positivo do gene patogênico para o mPCR.

8  Primers e amplificação do PCR - Os primers usados estão listados na tabela 2. - Testou-se a progressiva incorporação dos primers correspondentes aos diferentes genes e várias combinações de temperatura de melting e concentração de primers. - Cada 25 µL da mistura de reação continha: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM HCl, 1,5 - 2,0 mM MgCl2, 2,5 mM de deoxinucleotsideo trifosfato, 1,25 U de Taq DNA polimerase, 25 – 50 µM de cada primer, e 2,5 µLde DNA modelo.

9  Primers e amplificação do PCR

10 Primers e amplificação do PCR  Denaturação 94°C 1 min  Anelamento 55°C 1 min  Extensão 72°C 1 min  Ao final, manteve-se a 72 °C por mais 10 min.  Separação por eletroforese (100 V, 40 min.) em gel de agarose  Revelação com brometo de etídio.

11  Aplicação do mPCR em isolamento clínico de E. coli - examinou-se pacientes ambulatoriais de hospitais privados entre Fevereiro de 2005 e Novembro de 2006 para: - Salmonella enterica - Shigella - Yersinia - Vibrio - Campylobacter - E. coli

12  Aplicação do mPCR em isolamento clínico de E. coli - Um total de 683 E. coli, como culturas puras foram isolados em placas de ágar de sangue de carneiro 5% e sorotipadas com anti-soros O. Eles foram identificados pelo Enterotube II. - Todas as cepas foram incubadas em ágar Kajiton, guardada a 4 °C antes do ensaio de mPCR.

13  As cepas controle foram analisadas por cada conjunto de primers para detectar os genes de virulência ( stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, ST gene, LT gene e astA);  Com o uso de 8 primers simultaneamente não foi possível detectar alguns genes;  Dividiu-se os primers Conjunto de primers 1 ( stx 1, eaeA, LT gene e astA)  Conjunto de primers 2 (stx 2, invE, aggR e ST gene)

14 - O gene ST não pôde ser detectado, então o primer do gene ST foi dividido em STh gene e STp gene.

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16  Todas as 683 amostras de pacientes com caso clínico de E.coli foram examinados por mPCR, e 51 DEC (EPEC, 21; EAggEC, 15; ETEC,9; STEC,6) e 38 E. coli positivo para astA foram detectados  5 das cepas de DEC eram O antígeno não sorotipável (OUT)  Todas as 683 cepas de E.coli foram analisados com um teste confirmatório com os 9 primers individualmente e os resultados foram idênticos aos obtidos com o mPCR.  Os 9 genes alvos e as 7 cepas controles foram detectadas por mPCR. A especificidade foi de 100% e a sensibilidade de 10 4 CFU/mL para todas as cepas

17  Para confirmar a suspeita de DEC, é frequente usar o PCR comum. No entanto, isolar a cepa e identificá-lo entre os 5 grupos é muito trabalhoso e gasta-se muito tempo. Usando o mPCR com os 2 grupos de primers pode-se reduzir o tempo e o esforço na análise de vários fatores de virulência.  Nenhuma relação entre o sorotipo e a inclusão entre um dos 5 grupos por mPCR. Portanto, o diagnóstico apenas por sorotipagem pode ser incompleto.  Este estudo provou a praticidade do emprego de mPCR pois ele detectou facilmente 9 genes responsáveis pela virulência de 5 categorias de DEC.