TRANSCRIÇÃO Biologia Molecular Profª Marília Scopel Andrighetti

O fluxo da informação é unidirecional Dogma central O fluxo da informação é unidirecional 2

TRANSCRIÇÃO DO DNA Processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA fita dupla; Processo bastante variável para atender as necessidades fisiológicas da célula; Apenas uma das fitas é utilizada como molde para a síntese do RNA (fita molde direção 3’→5’). A outra fita é idêntica à fita de RNA sintetizada (fita codificadora direção 5’→3’), com a substituição de T por U;

Fitas molde e codificadora 4

O molde é local Genes podem ser transcritos utilizando uma das fitas de DNA como molde, enquanto outros podem utilizar a outra fita do DNA. A escolha da fita molde depende da localização e orientação do promotor 5

TRANSCRIÇÃO DO DNA RNA informacional: RNA mensageiro. Sempre é codificado em polipeptídeos pela tradução; RNA funcional: nunca são traduzidos em polipeptídeos e sua ação é puramente no nível de RNA. Ex: tRNA, rRNA, e outros pequenos RNA's; Síntese do RNA: RNA polimerase + ribonucleosídeos trifosfatados.

A maquinaria de transcrição 7

ATIVIDADES DA RNA POLIMERASE Reconhecem e ligam-se em sequências específicas do DNA; Desnaturam o DNA na altura dos nucleotídeos que serão transcritos; Mantém as fitas de DNA separadas na região de síntese; Estabiliza o híbrido DNA:RNA na síntese; Renatura o DNA imediatamente após a síntese; Termina a síntese sozinha, ou com ajuda de proteínas.

RNA POLIMERASE - EUCARIOTOS RNA polimerase I – localizada no nucléolo e responsável pela síntese do RNA ribossômico; RNA polimerase II – localizada no nucleoplasma e responsável pela síntese do RNA mensageiro; RNA polimerase III – também localizada no nucleoplasma e responsável pela síntese do RNA transportador.

RNA POLIMERASE - PROCARIOTOS Subunidade Papel a Participa da iniciação, liga-se a sequências reguladoras b Participa da iniciação e alongamento, forma ligações fosfodiéster b' Liga-se a molde de DNA s Reconhece promotor, inicia síntese (dissociando-se logo após)  10

TRANSCRIÇÃO DO DNA A ligação ocorre entre o ribonucleotídeo presente e o fostato do C5’ do ribonucleosídeo trifosfatado a ser incorporado; A RNA polimerase não necessita de primer para iniciar a síntese.

Não é que parece com a replicação? 12

TRANSCRIÇÃO DO DNA INÍCIO Reconhecimento de sequências específicas no DNA ALONGAMENTO Incorporação dos ribonucleotídeos TERMINAÇÃO Sequências no DNA são reconhecidas e a síntese é interrompida

INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO O DNA apresenta sequências específicas, denominadas PROMOTORES, que sinalizam exatamente onde a síntese do RNA deve ser iniciada; São sequências de 100 a 200 nucleotídeos próximos ao sítio de início da transcrição; Os promotores são, primeiramente, reconhecidos por fatores de transcrição que, ligados ao DNA, interagem com outros fatores, formando um complexo ao qual a RNA polimerase se associa; A RNA polimerase liga-se frouxamente à dupla fita de DNA e reconhece o promotor.

INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO No promotor, 2 sequências são altamente conservadas: a -10 (TATAAT) e a -35 (TTGACA), as quais separam-se por, aproximadamente 17 nucleotídeos; O primeiro nucleotídeo a ser transcrito é geralmente uma purina – A ou G; A região -10 recebe o nome de TATAbox; Elementos “enhancer” ou amplificadores são sequências pequenas de DNA que podem ocorrer na região 5’ do gene, as quais ativam a expressão do mesmo.

INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO A holoenzima RNA polimerase liga-se especificamente nas regiões -10 e -35 em uma das faces da dupla fita (fita molde). Essa ligação ocorre na cavidade maior do DNA, onde as bases estão acessíveis a proteínas.

INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO Após a ligação da RNA polimerase, forma-se o complexo de iniciação da transcrição; O complexo abre-se formando a bolha de transcrição; Essa abertura ocorre na região -10 (TATAbox) a qual é rica em AT.

INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO Ocorre a incorporação de 2 primeiros ribonucleotídeos e a formação da ligação fosfodiéster; Após, a enzima sintetiza alguns oligonucleotídeos de 2 a 9 pb; Enquanto o fator  permanece ligado na enzima (fator que reconhece o sítio de início da transcrição), a enzima não se desloca; Depois que o fator  se desliga, a enzima fica livre para se deslocar e iniciar a fase de alongamento; O promotor e o fator  ficam livres para iniciar outro ciclo de transcrição.

Subunidade Sigma -- σ A subunidade sigma da RNA polimerase é fundamental para o reconhecimento específico da região promotora. Ela, juntamente ao cerne da enzima, desliza ao longo do DNA à procura do promotor, não precisando desenrolar a dupla hélice. 20

Sigma na iniciação da transcrição 21

E onde fica o RNA? É feito no núcleo e depois vai para o citoplasma Mas procarioto não tem núcleo... Por isso se diz que sua transcrição é acoplada com a tradução 22

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O RNA vai para o citoplasma Eucariotos O RNA vai para o citoplasma 24

Transcrição em procariotos 25

ALONGAMENTO DA CADEIA A polimerase desliza ao longo da fita molde estendendo uma cadeia de RNA crescente no sentido 5’3’ através da adição de ribonucleotídeos; Durante o alongamento, 18pb estão desnaturados e 12pb formam um híbrido DNA:RNA; O deslocamento da RNA polimerase gera superenrolamento positivo à frente da bolha de transcrição e negativo atrás da mesma, sendo necessárias topoisomerases para o bom funcionamento da enzima; Este processo ocorre até a RNA polimerase encontrar uma sequência específica no DNA que determina o término do alongamento.

TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Quando a RNA polimerase encontra o sítio de terminação na fita molde, ela se desliga do DNA juntamente com a nova cadeia de RNA sintetizada devido à uma desestabilização do complexo de transcrição; O desligamento do RNA do sistema provoca a ruptura do complexo de transcrição e as fitas do DNA são renaturadas.

TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Em procariotos a região terminadora apresenta uma longa sequência de A na fita molde. A RNA polimerase , ao longo do pareamento AU (mais fraco) desestabiliza o híbrido DNA:RNA e o DNA é renaturado; Em eucariotos, as 3 RNAs polimerases terminam a síntese em regiões de DNA ricas em T.

ATIVIDADES PÓS-TRANSCRICIONAIS Em procariotos, logo após o RNA ser liberado da bolha de transcrição, os ribossomos se ligam e iniciam a tradução; Em eucariotos, os RNAs sintetizados no núcleo durante o processo de transcrição são chamados de transcritos primários (hnRNA); Na maioria das vezes, esses transcritos não representam a molécula madura, ou seja, aquela cuja sequência e estrutura correspondem à forma final do RNA funcional (mRNA); Esses transcritos necessitam sofrer modificações que fazem parte do processamento do RNA.