Tâmara Guindo Messias – tgmessias@cena.usp.br CEN 5738-4 Ecotoxicologia Daphnia Tâmara Guindo Messias – tgmessias@cena.usp.br

Daphnias Invertebrados de água doce Subfilo crustáceo (crusta = carapaça dura) - ordem cladócera Pulga de água – forma como nadam Partenogênese - condições ideais Crescimento mudas As daphnias são invertebrados de água doce, que pertencem ao subfilo crustáceo (no latim crusta significa carapaça dura) e da ordem cladócera. Esses organismos são chamados vulgarmente de Pulga da água – devido a forma como nadam impulsionado por suas antes, a daphnia parece pular como pulam as pulgas terrestres. As daphnias reproduzem-se por partenogênese, em condições ideais, essa reprodução é assexuada e os filhotes são idênticos a mãe, ideal para os teste porque evita variação genética. O crescimento e nascimento dos filhotes se dá pelo processo de muda, que é a troca dessa carapaça transparente de 2 em 2 dias.

Daphnias Verão – Partenogênese – Fêmeas Baixa tº - Daphnias macho Machos tem a 2º antena Função na copulação No ambiente – durante o verão as daphnias reproduzem-se por partenogênese, sendo sua população composta majoritariamente por fêmeas com a diminuição das temperaturas os ovos que se estavam a desenvolver dão origem a dáfnias machos. Os machos utilizam as segundas antenas para segurar a fêmea na copulação.

Daphnias Ovos de inverno – condições desfavoráveis Ephippium – flutuar, congelar e ser ingeridos pelos animais; Resistente as enzimas digestoras Possuem camada protetora – restos da cavidade incubadora Resistem até 20 anos Os ovos gerados da reprodução sexuada, são chamados de ovos de inverno porque só são produzidos quando as condições de desenvolvimento são desfavoráveis. Esse ovo tem essa característica diferenciada (preta) com uma capa protetora, a qual envolve todos os ovos internos, esse ovo é chamado de ephippium e estes são resistentes podendo flutuar, congelar, ser transportados para outros ambientes ou ainda ser ingeridos pelos animais que ainda resistem, estes são resistentes as enzimas digestoras por possuirem uma camada protectora constituída pelos restos da cavidade incubadora das suas progenitoras, os ovos resistem durante um máximo de vinte anos até que se reúnam as condições necessárias para se desenvolverem. Esta é uma característica importante para a proliferação e colonização da espécie em novos habitats.

Ciclo da daphnia Paternogênese cíclica; As fêmeas podem gerar machos Reproduzir sexuadamente Ephippium Em condições ideais as daphnias reproduzem-se por patergonênese, formando organismos idênticos as mães, em condições desfavoráveis são gerados filhotes machos, os quais irão se reproduzir sexualmente com as fêmeas, formando o ephippium

Daphnias Perda exoesqueleto – muda Filtram o alimento da água no tubo digestivo Apêndices - alimentação 1º e 2º retêm as partículas de maior suspensão Os outros apêndices impulsionam para a entrada de água Ao longo do seu crescimento as dáfnias vão perdendo várias vezes o seu exoesqueleto esse processo denomina-se muda. Para se alimentarem filtram o alimento da água que passa pelo seu tubo digestivo. As suas pernas ou apêndices articulados estão especializados para a alimentação. O primeiro e o segundo par de apêndices retêm as partículas de maior dimensão, enquanto que os outros pares de apêndices impulsionam a água para que esta possa entrar pela sua boca levando consigo o alimento.

Daphnia Exoesqueleto transparente; 28ºC – 29 dias Podem chegar até 108 dias de vida em 3ºC Inverno – população fica limitada, mas as fêmeas sobrevivem até 6 meses – crescimento é lento Devido ao facto destes animais terem um exoesqueleto transparente, é possível observar na lupa todas as partes que o constituem, desde o coração a bater até ao desenvolvimento embrionário na sua cavidade incubadora. A sua esperança de vida não excede um ano, dependendo das temperaturas, um indivíduo pode sobreviver 108 dias a temperaturas de 3º C e sobreviver apenas 29 dias a temperaturas de 28º C. No inverno existem exceções, a população fica muito limitada mas várias fêmeas sobrevivem até cerca de seis meses tendo um crescimento lento mas atingindo maiores proporções que as fêmeas que se desenvolvem em condições normais.

Espécies de daphnias D. laevis D. ambigua D. similis D. galeata Algumas espécies de daphnias C. dubia D. rosea D. pulex D. magna

Por que as daphnia? Amplamente conhecida; Facilmente cultivada; Reprodução freqüente; Pequena infra-estrutura; Custo para manutenção são acessíveis; Respostas rápidas devido ao seu ciclo de vida; As daphnias tem sido utilizadas como organismos testes por ser amplamente conhecido, facilmente cultivado e mantido em laboratório e por ter reprodução freqüente, o que garante o suprimento para testes constantes, precisa-se pequena infra-estrutura, os custos para manutenção são baixos e as respostas aos agentes ambientais são rápidas devido ao seu ciclo de vida.

TESTE DE TOXICIDADE COM Daphnia Princípios: Exposição dos organismos; Várias diluições e tempo determinado; Toxicidade aguda - OECD (1984) e Dutka (1997) Toxicidade crônica – ISO (1996) e ABNT (2003a) O princípio do teste consiste na exposição dos organismos a varias diluições da amostra a ser testada por um período determinado de tempo. Levando em consideração o tempo de exposição e os resultados obtidos, os testes de toxicidade podem ser agudos ou crônicos

Objetivos dos testes Teste aguda Determinar CL50 - 24 e 48 h – Baseado na mortalidade e/ou imobilidade Teste crônico Avaliar efeitos no crescimento, reprodução e desenvolvimento do animal.

Teste agudo Concentrações – 0,01; 0,1; 1; 10; 100 e 1000 mg/L; 5 organismos - 3 ou 4 réplicas; 24 h de vida - tº 22 ou 23ºC; Luminosidade 12/12 escuro e claro; Duração – 24 ou 48 h – imobilidade e morte

TESTES CRÔNICOS COM DAPHNIA Princípio do teste = toxicidade aguda As diferenças: Número de réplicas 10 Tempo de duração – 21 dias Foto-período: 8h escuro – 16 h claro Alimentação diária e troca de meio de 2 em 2 dias   Aqui vou falar dos testes cronicos

Estudos Estudos de qualidade da água dos rios; Qualidade da água de reuso; Derramamentos de petróleo; Resíduos de praguicidas, herbicidas em geral

Estudos Liberação de novos produtos químicos; Resíduo de industria têxtil; Em metais pesados e hidrocarbonetos; Vinhaça tratada e não tratada com fungos basidiomicetos. Entre outros sugeridos.

D. magna Micro-crustáceo de água doce Requerido pela legislação nacional e européia para avaliação de novos agentes químicos, efluentes urbanos e industriais 1,5 mm comprimento Exoesqueleto - carapaça (transparente) – Morfologia e alteração dos batimentos cardíacos – nicotina, álcool, café e poluentes. As Daphnias magna assim como as daphnias em geral, são micro-crustáceos de água doce. A utilização desse organismos nos testes de toxicidade é requerido não apenas pela legislação ambiental nacional, mas também pela legislação Européia e, são utilizados para avaliar os novos agentes químicos, efluentes urbanos e industriais e contaminações ambientais. As D. magna tem em torno de 1,5 mm de comprimento quando adultas, apresentam um exoesqueleto transparente que permite observar sua morfologia interna e a alteração dos batimentos cardiacos quando na presença de substâncias como a nicotina, o álcool, café e poluentes.

D. magna Reprodução assexuada – partenogênese 6 a 10 dias – primeira ninhada Juvenis de 2 em 2 dias Alimenta de alga, fermento biológico e ração de truta Requerido pela legislação nacional e europeia pra avaliação de novos agentes químicos, efluentes urbanos e industriais A D. magna cultivada em laboratório reproduz-se assexuadamente por partenogênese cíclica. As D. magna precisam de 6 a 10 dias para estar na fase adulta e dar origem a sua primeira ninhada. Os juvenis nascem de 2 em 2 dias, com aproximadamente 15 juvenis por ninhada. Esses organismos alimentam-se de uma suspensão de alga (P. subcapitata), fermento biológico e ração de truta. Na cadeia alimentar as Daphnias são as principais presas dos peixes.

Meio de cultivo D. magna  Meio de cultivo - Meio Elendt M4 - OECD (1998) Água destilada + adições de sais Soluções-estoque mantidas a 4ºC Aeração de 24 h pH = 7 a 8; dureza = 250  25 mg de CaCO3/L. O meio de cultivo utilizado é o meio Elendt M4 – OECD (1998), np preparo desse meio é utilizada água destilada mais sais. Primeiramente são utilizados os sais para fazer as soluções estoque que são armazenadas em geladeira a 4ºC, essa solução estoque é utilizada no preparo do meio. Quando o meio já está pronto é colocada aeração de pelo menos 24 horas, podendo deixar até 48h quando então é ajustado o pH para 7, e medida a dureza que deve estar em torno de 250.

Cultivo Becker de 2L 20 a 23 fêmeas Incubadas a 23ºC Alimentados e troca do meio – 3 vezes por semana; Idade das culturas é de 30 a 40 dias; Após esse período as culturas são renovadas. No laboratório as Daphnias são cultivadas em becker de 2L, onde são colocadas de 20 a 23 fêmeas, o becker é coberto com xxx. As fêmeas são alimentadas três vezes por semana, quando trocamos as águas, retiramos as carapaças restante das mudas e retiramos os filhotes. A idade das culturas é de até 40 dias, quando são montadas novas culturas.

Experimentação Com D. magna

Teste de sensibilidade com D. magna Solução estoque de NaCl em balão volumétrico; Rotular os frascos utilizados nos testes; Separar os neonatos de até 24 h de vida Erlenmeyer (125 mL) Serão realizados os teste com uma amostra conhecida, com a qual realizamos os testes de sensibilidade, que é uma solução se sal. Os frascos são rotulados previamente e são separados os neonatos de até 24 h necessários para a realização dos teses. As soluções e diluições da amostra de sal serão diluídas em água e utilizando um erlenmeyer.

Leitura do teste e análise dos dados Meio de Cultura Solução de NaCl 5 neonatos 25 mL Leitura do teste e análise dos dados

Obrigada ! Tâmara Guindo messias tgmessias@cena.usp.br