Mutações MECANISMOS DE REPARO DO DNA SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia

TERMINOLOGIA Mutagênicos: causam mutações de ponto Clastogênicos: causam alterações na estrutura cromossômica Carcinogênicos: aumentam o risco de aparecimento de tumores Turbagênicos (aneugênicos): atuam nos processos envolvidos no fuso celular (aneuploidias) Citotóxicos: morte celular

PRODUTOS QUÍMICOS USADOS EM LABORATÓRIO Peróxido de hidrogênio: causa danos ao tecidos e ao DNA. Corantes: geralmente são carcinogênicos; principalmente os corantes fluorescentes são intercalantes do DNA (mutagênicos e carcinogênicos). Brometo de etídeo, Diaminobenzidina e 5-Bromo-2`-Deoxyuridine-(BrDu) são carcinogênicos e mutagênicos. Éter: pode provocar lesões no fígado e afetar o sistema nervoso central Clorofórmio: causa irritação à pele, olhos e trato respiratório, afeta Sistema Nervoso Central, rins, Sistema Cardiovascular e fígado. Pode causar câncer dependendo do nível e duração de exposição. Fenol: Corrosivo, irritante das membranas mucosas, causa severas queimaduras, afeta o sistema nervoso central, fígado e rim. Xilol: Afeta o sistema nervoso central. Causa severas irritações na pele, olhos e trato respiratório. Pode ser danoso se absorvido pela pele. Metanol: Causa irritação na pele, olhos e trato respiratório. Afeta o sistema nervoso e o fígado. Acrilamida e Bis-acrilamida: são mutagênicas, causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.

(Vit E) -compostos fenólicos, fibras, clorofila, b -caroteno, vitaminas (C e E). Rev. Nutr. vol.13 no.2 Campinas May/Aug. 2000

TIPOS DE LESÕES NO DNA Estimativa: 100.000 lesões célula/dia (quebras SSB, perdas de bases espontâneas, outras lesões) Exposição ao sol (UV): induz 100.000 fotoprodutos/queraticócito

Preservação da Integridade do Genoma Mecanismos para manutenção do genoma: Sistemas de checkpoint e tolerância Diversos mecanismos de reparo do DNA Ativação do câncer e senescência, ou morte celular

LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR ATM P53 Reparo do DNA Bloqueio do ciclo celular (Checkpoint) Danos DNA Apoptose Câncer Doenças genéticas Síndromes de instabilidade cromossômica Envelhecimento

MECANISMOS DE REPARO DO DNA Reparar danos no DNA surgidos espontaneamente ou induzidos por mutágenos Reparo direto Reparo de pareamento errôneo (mismatch repair) Reparo de excisão de bases Reparo de excisão de nucleotídeos Reparo de quebras de fita dupla no DNA: - Reparo Homólogo ou Recombinação - Reparo da junção das extremidades

Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) → remove o grupo metil REPARO DIRETO reversão ativa da lesão → sem retirar a base danificada → muito eficiente O6-metilguanina → transição G:C para A:T (produzida endogenamente ou mutagênicos químicos alquilantes) Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) → remove o grupo metil alto custo energético → uma molécula da enzima é inativada para cada lesão corrigida

Reparadas pela O6-metilguanina DNA metiltransferases (MGMT)   O6-metil guanina O6-etil guanina E.coli e mamíferos Transfere grupo alquil (metila) para uma cisteína da DNA metiltransferase A proteína é inativada

DNA restaurado e enzima inativa REPARO DIRETO Agente alquilante G C CH3 O6-Metilguanina G C G C CH3 Reconhecimento da base alterada e transferência do grupo metil para resíduo de cisteína da MGMT Reparo Direto MGMT G C MGMT CH3 DNA restaurado e enzima inativa

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO MISMATCH REPAIR - MMR reparo pós-replicação: bases incorporadas erroneamente no DNA durante a replicação (DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb) REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: DNA pol com atividade exonuclease 3’  5’: corrige 99,9% dos erros de replicação eliminação de bases mau pareadas e alças de deleção/inserção atua na cadeia recém-sintetizada → logo após a replicação do DNA Genes em humanos: MSH, MLH e PMS → as proteínas formam complexos (heterodímeros) Genes em procariotos: MutS, MutL e MutH

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO MISMATCH REPAIR - MMR Deslizamentos da DNA Polimerase em regiões de microssatélite  sofre deslocamento e produz filamento de DNA com bases extras  formam alças

mutações em MLH1 e MLH2 são mais comuns Mutações em genes MMR segregam com a síndrome de predisposição ao câncer colorretal não polipose (HNPCC)  maioria dos pacientes são heterozigotos para mutações recessivas na linhagem germinativa em genes MMR (MLH, MSH, PMS) células tumorais sofrem perda do alelo normal e exibem instabilidade de microssatélites números variáveis de repetições de microssatélites nas células tumorais Câncer de cólon não-poliposo familial: instabilidade de microssatélites 70 a 85% de risco mutações em MLH1 e MLH2 são mais comuns

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO G A 5’ 3’ Cadeia filha Cadeia parental Base errada MSH3 Reconhecimento do dano e corte na cadeia filha G A MSH2 MSH6  MLH2 PMS2 A G Excisão de fragmento de 100 a 1000pb contendo a base incorreta Síntese de DNA e ligação da fita reparada A DNA pol / DNA ligase Fita reparada T A

Reparo de excisão de bases REPAROS DE EXCISÃO: Reparo de excisão de bases Reparo de excisão de nucleotídeos ETAPAS COMUNS etapa 1 = incisão (endonuclease) e excisão (exonuclease) etapa 2 = ressíntese do DNA (DNA polimerases β, δ, ε) etapa 3 = ligação das extremidades (DNA ligases)

REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER reparo de danos causados por agentes endógenos (danos oxidativos (ROS)  oxigênio reativo,radicais livres H2O2, hidrólises)  que modificam a estrutura das bases reparo de danos induzidos por radiação ionizante e agentes alquilantes realizado pelas DNA glicosilases: cada DNA glicosilase (~ 8 genes diferentes) reconhece uma base alterada no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise Ex.: uracila-DNA-glicosilase  remove a uracila do DNA (desaminação da C  U)  transição GC  AT - quebram ligações base-açúcar liberam as bases gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (sítios AP) sítio reparado por endonucleases específica

REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER Etapas: remoção da base danificada (DNA glicosilase)  sítio AP incisão do sítio AP na porção 5’ (endonuclease) excisão do terminal 5’ e remoção (exonuclease)  gerando lacuna de 1 nucleotídeo (via curta) ou 2-12 nucleotídeos (via longa) síntese DNA (DNA polimerase) ligação da cadeia (DNA ligase)

REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER Quebra de cadeia simples * Base danificada DNA glicosilase Reconhecimento e formação do sítio AP XRCC1 PARP Reconhecimento da quebra APE1 Reconhecimento e incisão 5’ do sítio AP  PNK  Incisão 5’ PCNA DNA pol  FEN1 XRCC1 DNA pol Excisão da porção açúcar-P e síntese de DNA Síntese DNA e excisão DNA ligase I Long-patch Ligação da cadeia XRCC1 DNA ligase III Ligação da cadeia Short-patch 1 nucleotídeo 2-13 nucleotídeos

realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG (humanos) REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NER remoção de adutos no DNA  distorção da dupla hélice dímeros de pirimidina (radiação UV) , HAP, cisplatina fatores ambientais principal mecanismo de reparo deficiência: doenças genéticas realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG (humanos) Bactérias: complexo UVrA, UVrB, UVrC e UVrD remove 22-30 nucleotídeos

Xeroderma Pigmentoso Mutações em XPA-XPG  1000 a 4000X o risco de câncer de pele  exposição solar ou irradiação UV

REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NER Etapas: Reconhecimento da lesão no DNA (complexo XPA-XPC)  ligam-se ao DNA danificado  abertura da dupla hélice  atividade de helicase  XPB e XPD Dupla incisão na cadeia danificada: 3’ (XPG) e 5’ (XPF) Excisão  remoção do segmento de DNA Síntese de DNA  DNA polimerase Ligação da cadeia  DNA ligase

Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) Reconhecimento dano (XPA-XPC)→ interação com TFIIH →atividade de helicase XPG: endonuclease que corta a fita em 3’ ERCC1-XPF: endonuclease que corta a fita em 5’ Fragmento 26-27 nucleotídeos DNA pol, PCNA, RPA e RFC: síntese da fita nova Ligase

SÍNDROMES ASSOCIADAS A DEFEITOS NO NER Reconhecimento da lesão Incisão Excisão: remoção dano Síntese reparo

COMPARAÇÃO ENTRE OS REPAROS BER E NER http://www.uenf.br/Uenf/Downloads/LBT_4516_1187792657.pdf

REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DSB (quebra fita dupla): lesão espontânea induzida por radicais de O2 livres, replicação do DNA e agentes genotóxicos como a radiação ionizante causa de aberrações cromossômicas Duas vias principais em mamíferos: Reparo recombinação homóloga (RH)  pareamento com o cromossomo homólogo intacto Reparo de ligação das extremidades não- homóloga (NHEJ)  religação direta das extremidades quebradas

REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA Reparo homólogo (RH)  Etapas Reconhecimento da quebra e pareamento do cromossomo homólogo intacto com o cromossomo que apresenta a quebra dupla Degradação das extremidades danificadas Deslocamento da cromátide-irmã intacta para o sítio a ser reparado A cromátide-irmã serve como molde para síntese de DNA  restaura a sequência original Ligação das extremidades

REPARO HOMÓLOGO Cromátides irmãs Reparo DNA com fidelidade Radiação ionizante Quebra de cadeia dupla DNA ligase DNA pol Degradação 5’-3’ Síntese de DNA e ligação das cadeias Rad50 MRE11 NBS1 Rad52 BRCA2 Rad51 BRCA1 Rad54 Invasão da cadeia

Processamento das extremidades DNA reparado com baixa fidelidade LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGAS Agente danificante DNA fita dupla Quebra de cadeia dupla DNA PKc1 Processamento das extremidades KU80 KU70 XRCC4 DNA ligase IV Ligação das extremidades DNA reparado com baixa fidelidade

Células em proliferação Células em proliferação ou não Ligação c/ RPA (proteína de replicação) e RAD51 (recombinase) Modificação das extremidades: KU70 e KU80 recruta DNA-PK (proteína quinase)  complexo Facilita o encontro da cromátide-irmã e invasão Ligação das extremidades pela LIG4+XRCC4 Ligação das extremidades pela LIG1

http://www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf

CLASSES DE DISTÚRBIOS AFETANDO A MANUTENÇÃO DO GENOMA Envelhecimento acelerado: síndromes progeróides 2. Tipos de câncer: 3. Envelhecimento acelerado e câncer

SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: ENVELHECIMENTO (PROGÉRIA) Síndrome Genes mutados Processo Afetado Sintomas Cockayne CSA, CSB, XPB, NER XPD, XPG Tricotiodistrofia XPB, XPD, TTDA NER Rothmund-Thomson RECQL4 Deficiência helicase (reparo de danos oxidativos) Hutchison-Gilford LMNA função da lâmina nuclear (Progéria)

SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: CÂNCER Síndrome Genes mutados Processo Afetado Câncer mama BRCA1, BRCA2 Reparo Homólogo familial (quebras duplas) Li-Fraumeni TP53 Checkpoint G1-S Câncer colorretal não- MSH2, MLH1 Mismatch repair polipose hereditário (MMR) (HNPCC)

SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: PROGÉRIA + CÂNCER Síndrome Genes mutados Processo Afetado Xeroderma pigmentoso XPA-XPG NER S. Bloom BLM Deficiência helicase (recombinação mitótica) Anemia de Fanconi FANC Reparo DNA crosslink Ataxia telangiectasia ATM Reparo DSB S. Werner WRN Deficiência helicase (recombinação/reparo DNA manutenção dos telômeros) Adolescência - 40 anos

SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA Xeroderma Pigmentoso Síndrome de Cockaine Tricotiodistrofia Anemia de Fanconi Ataxia telangiectasia Síndrome de Bloom SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA  freqüência  aberrações cromossômicas  incidência  câncer

manifestações cutâneas (1,5 anos) XERODERMA PIGMENTOSO (XP)  AR  Clínica manifestações cutâneas (1,5 anos) anomalias oculares (4 anos) anomalias neurológicas progressiva (6 meses) primeiro câncer de pele (8 anos) Xeroderma (pele seca) Incidência: 1/250.000 (USA) e 1/40.000 (Japão) Células XP: sensíveis a radiação UV indivíduos incapazes reparar dímeros TT: risco ↑ câncer de pele (2000x) XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos (NER)

grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas defeitos enzimáticos incapacidade de excisar danos induzidos pela luz UV e mutagênicos químicos  diagnóstico exposição a luz solar  tratamento proteção da pele da luz solar chapéus óculos que absorvem luz UV bloqueadores solares roupas protetoras acompanhamento periódico por dermatologista

Síndrome de Cockayne Características: Anormalidades esqueléticas: face parecida com a de um passarinho - Cáries, cifose e osteoporose em pacientes de idade avançada. - Degeneração neurológica progressiva: início precoce, desenvolvimento psicomotor atrasado, defeitos no modo de andar e retardo mental. Microcefalia Perda da audição, retinopatia pigmentar, cabelos finos e cataratas Morte: 12,5 anos principais causas: pneumonia e infecções respiratórias

Alterações genéticas: Dois genes com mutações foram identificados nesta síndrome: CSA e CSB. O gene CSA, responsável pela síndrome de Cockayne do tipo 1→ cromossomo 5. O gene CSB, responsável pela síndrome de Cockayne do tipo 2 → cromossomo 10q11. Reparo defeituoso: NER

TRICOTIODISTROFIA (TTD) AR Clínica cabelos quebradiços (deficientes S) iquitiose (escamas de peixe) retardo mental e físico fácies distintivas orelhas protuberantes queixo retraído

TTD XPB XPD  descrita 1968 Pollitt e colaboradores  1/2 pacientes fotossensibilidade NER defeituoso  TTD não desenvolvem câncer de pele TTD XPB XPD Helicases do fator de reparo/transcrição TFIIH 30 grupo de complementação: TTD-A (fator de transcrição basal)

alterações da pigmentação da pele (64%) baixa estatura (62%) ANEMIA DE FANCONI (FA) AR Clínica anemia alterações da pigmentação da pele (64%) baixa estatura (62%) malformações do rádio (50%) anomalias oculares (41%), renais (34%), microcefalia (37%), deficiência mental (25%) 90% anemia aplástica

descrita 1927 Guido Fanconi  incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos  8 grupos de complementação: FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F e FA-G heterogeneidade genética

 células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA: mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ... freqüência  de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e multirradiais.

retardo de crescimento pré e pós-natal (145 cm H; 130 cm M) SÍNDROME DE BLOOM (SB) AR Clínica  peso ao nascimento retardo de crescimento pré e pós-natal (145 cm H; 130 cm M) telangiectasias e fotossensibilidade (borboleta) cabeça alongada, microcefalia, inteligência normal imunodeficiência: infecções (respiratórias e gastrointestinais)

Incidência: 1/58.000 judeus asquenazim  figuras quadrirradiais mutações no gene BLM 15q26.1 DNA helicase ( RecQ) papel na replicação e reparo do DNA Risco maior de câncer: carcinomas, leucemias e linfomas

-ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR AR Clínica -ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora -telangiectasia olhos e pele (3 e 5 anos) retardo de crescimento (70%) incidência neoplasias (linfoma e leucemia linfóide) e imunodeficiências incidência: 1/40.000 risco  câncer de mama heterozigotos AT

células AT sensíveis a radiação ionizante e agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-aminofluoreno - 4-NQO)  linfócitos AT rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14  4 grupos de complementação: A, C, D e E mutações gene ATM  gene ATM (11q22-23) diversas vias controle transdução de sinal checkpoint ciclo celular resposta celular ao dano no DNA induzido por radiação  gene ATM interage p53 na checagem G1-S e mutações no gene ATM abolem mecanismo de reparo pré-síntese de DNA  defeito mecanismo de reparo do DNA ou defeito na replicação DNA