Biotecnologia Paulo Marques

Processos biológicos → difícil de definir o começo → funcionam de forma muito integrada.   CÉLULAS: Unidade fundamental da vida – Menor parte de um ser vivo capaz de desenvolver, de forma autônoma, as funções básicas que caracterizam a vida: Reprodução e Crescimento. Organismos vivos → unicelulares e pluricelulares ↓ células assumem diferentes formas e se especializam em várias funções diferenciação celular

PROCARIONTES EUCARIONTES CÉLULAS – local de muitas reações químicas e suas funções dependem das substâncias químicas que produzem.   CÉLULAS ENTRE AS ESPÉCIES – com muitas diferenças, mas também com muitas similaridades → TODOS OS ORGANISMOS DESCENDEM DE UM ANCESTRAL COMUM! ↓ PROCARIONTES EUCARIONTES

CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DAS CÉLULAS: inorgânicos e orgânicos ↓ ↓ água, sais min. Carboidratos, lipídios proteínas e ác. Nucléicos   PROTEÍNAS E ÁC. NUCLÉICOS – IMPORTANTES PARA A BIOL. MOLECULAR ÁCIDOS NUCLÉICOS – DNA E RNA → controlam de forma integrada a síntese de proteínas O código do DNA – moléculas de DNA e proteínas são lineares ↓ linear segundo a seqüência de nucleotídeos cada 3 letras = 1 aminoácido SÍNTESE DE PROTEÍNAS – DNA →RNAm → Proteína Quando ocorre um erro - MUTAÇÃO

1. HISTÓRICO O advento da Biologia Molecular 1940 - Bases da Biologia Molecular: estudo da estrutura e função das moléculas biológicas. 1944 – Avery, MacLeod e McCarty – ácido desoxirribonucléico (DNA) continha a informação genética.

1952 – Hershey e Chase - DNA tem a capacidade de controlar as células : experiência com bacteriófagos. 1950 – Chargaff – distribuição dos nucleotídeos (identificados pelas bases nitrogenadas) possuia um padrão: quantidade de timina era igual a de adenina e guanina igual a de citosina. 1953 – utilizando os dados sobre a molécula de DNA obtidos através de cristalografia de raios X por Rosalind Franklin, James Watson e Francis Crick propuseram o modelo dupla hélice do DNA: duas cadeias de nucleotídeos enroladas em espiral e ligadas entre sí pelas bases - como o material genético se duplica e produção do RNA , síntese protéica e controle da atividade celular).

1956 – processos de autoduplicação do DNA 1960 – decifração do código genético dos aminoácidos 1961 – processo de transcrição do RNA. 1962 – processo de tradução do RNA para sintetizar proteínas.

Estrutura do DNA

Estrutura de Dupla Hélice Capacidade de Replicação (Watson e Crick - 1953) Capacidade de Replicação

A Molécula de DNA

Tipos de DNA

Há pelo menos três modelos de DNA : Modelos A, B e Z O DNA B é de longe o mais frequente, mas o DNA Z tamém é encontrado na célula. Admite-se que o DNA Z é "silencioso", isto é, não pode ser transcrito. A transição B-Z seria, assim, um recurso para silenciar grandes blocos de genes. A forma Z é também a única que é imunogênica, isto é, quando um paciente tem anticorpos contra DNA, é contra esta forma que eles são produzidos.

DNA: A, B e Z. Nesta figura está bem visível a fenda maior entre a volta verde de cima e a vermelha de baixo e a menor, entre a vermelha de baixo e a verde da base, no modelo B. Também fica claro que os dois modelos A e B são hélices destrógiras, enquanto o Z é levógiro. DNA Z não tem duas fendas nítidas, mas uma escancarada e outra muito discreta.

CLASSES DE DNA O DNA das células eucariontes apresenta três frações caracterizadas pelo grau de repetição: DNA Singular ou de Cópia Única Constitui a maior parte do DNA no genoma. As sequências que codificam proteínas (isto é, a porção codificadora dos genes) compreendem apenas uma pequena proporção do DNA de cópia única. A maior parte do DNA de cópia única encontra-se em extensões curtas, entremeadas com diversas famílias de DNA repetitivo . Proporção do genoma: 75% .

DNA Repetitivo Disperso Consiste em sequências relacionadas que se espalham por todo o genoma, em vez de ficarem localizadas. Os elementos repetidos dispersos mais exatamente estudados pertencem à família Alu e à família L1.

DNA Satélite Envolve sequências repetidas (em tandem) agrupadas em um ou em alguns locais, intercaladas com sequências de cópia única ao longo do cromossomo. As famílias de DNA satélite variam quanto à localização no genoma, comprimento total da série em tandem, comprimento das unidades repetidas que constituem a série.

TRANSPOSONS Transposons - moléculas que “copiam e colam” Transposons são pedaços de DNA que podem copiar e inserirem-se em regiões não-homólogas de outros DNAs na mesma célula. Transposons = Transposição

DNA: Processos de replicação, Transcrição e Tradução

Controle da expressão gênica

Jacob e Monod criaram um modelo no qual o sítio promotor, associado a um outro sítio chamado operador, controlava a expressão de todos os genes imediatamente “abaixo”, isto é, 3’, do promotor. A este conjunto chamaram operon. Como os genes que estudavam eram os responsáveis pela síntese das proteínas que degradavam lactose, chamaram a este arranjo de genes operon lac.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE   À partir do conhecimento da molécula de DNA, os cientistas agora querem administrar essa fábrica de proteínas!!   DNA – molécula relativamente simples e muito regular; varia só nas 4 bases (com caract. químicas muito semelhantes) e são macromoléculas com as mesmas propriedades químicas. ↓ pelo comportamento químico é impossível separar uma molécula de DNA ↓ TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ↓ O DNA é extraído da célula com o gene de interesse – cortado em fragmentos menores de modo controlado - cada fragmento é ligado em uma outra molécula de DNA – célula hospedeira ↓ célula com a molécula híbrida, passa a copiá-la, duplicando-a em cada divisão celular – com grande quantidade da molécula é possível localizar o gene.   Isolar o gene – multiplicá-lo e obter grande quantidade da proteína ↓ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (endonucleases)  

2. Introdução à Engenharia Genética Utilizando as enzimas de restrição bacterianas, tornou-se possível cortar dois DNAs diferentes e, pela ação de enzimas ligases, unir os segmentos resultantes e formar um DNA recombinante - Tecnologia do DNA Recombinante – início da Engenharia Genética. Assim, os cientistas têm desenvolvido técnicas que possibilitam transferir os genes de um tipo celular para outro (por exemplo, de plantas e animais para as bactérias).

Aplicações comerciais: o futuro da engenharia genética é considerado muito amplo, sendo que já resolveu alguns dos maiores problemas de pesquisa. Por exemplo, genes que codificam a produção de compostos importantes, com produção reduzida em seu tecido normal, podem ser retirados de células animais ou vegetais e inseridos na célula bacteriana- esta sintetiza em quantidades ilimitadas os produtos codificados pelos genes. Muitos exemplos de sua aplicação são observados na medicina. Outra aplicação importante é a transformação de plantas, animais e microrganismos para a obtenção de Transgênicos (OGM).

3. Importância dos Microrganismos e das Enzimas na Engenharia Genética As células animais e vegetais usualmente não podem ser cultivadas para produção de compostos específicos – estas perdem a habilidade de síntese quando são isoladas e cultivadas em laboratório. Também , o cultivo de células de tecido em laboratório é dispendioso e requer meios complexos altamente enriquecidos. Uso de microrganismos – medicina: altamente empregado, pois evita muitos dos problemas associados com a obtenção de compostos importantes (insulina, interferom, hormônios, etc.). As bactérias que carregam os genes para os mais diversos compostos, podem ser cultivadas indefinidamente.

Por meio da introdução de genes estranhos em microrganismos, é possível desenvolver cepas que oferecem novas soluções para problemas diversos, como poluição, escassez de alimento e energia , controle de doenças e até mesmo terapia gênica. ENZIMAS: fundamental para a tecnologia do DNA recombinante. Endonucleases de restrição: apresentam papel fundamental, clivando o DNA em seqüências específicas, gerando um conjunto de fragmentos menores. DNA ligase: os fragmentos separados para serem clonados podem ser unidos a um vetor de clonagem apropriado usando a DNA ligase. Assim, o vetor recombinante é introduzido numa célula hospedeira que o “clona”, a medida que a célula realiza muitas gerações de divisões celulares.

Vetores de Clonagem Plasmídios – bacteriófagos – cosmídios - E. coli. Plasmídios : moléculas de DNA circulares que se replicam separadamente do cromossomo hospedeiro. Plasmídios bacterianos naturais – 5.000 a 400.000 pares de bases. Plasmídios introduzidos nas células por técnicas de transformação Utilizados para clonar segmentos de DNA até 15.000 pares de bases.

Construção de uma Bactéria pela Engenharia Genética Obtenção do gene do organismo doador ou, em alguns casos, pode ser sintetizados em laboratório pôr nucleotídeos artificiais. DNA plasmidial (ou outro vetor de clonagem) é isolado para servir como carreador de determinado gene. O DNA doador e o plasmidial são tratados com a mesma enzima, uma endonuclease de restrição, que cliva o DNA, formando fitas simples com terminais complementares (“terminais coesivos”). Esses são capazes de ligar-se a outros fragmentos de DNA que apresentam o mesmo terminal complementar das fitas simples.

O terminal coesivo de um fragmento de DNA doador liga-se com o terminal coesivo do DNA plamidial através da DNA ligase → plasmídio com o fragmento do DNA doador. O plasmídio é adicionado a uma suspensão de bactérias receptoras  transformação. As bactérias geneticamente construídas são propagadas em grande quantidade e o produto (proteína) codificado pelo gene transferido é extraído da cultura e purificado. Ou outro caminho é colocar esta bactéria transformada com outro tecido e fazer a transferência do gene.

Isolamento e amplificação de plasmídios

Bacteriófago λ : clonagem de segmentos de DNA maiores Bacteriófago λ : clonagem de segmentos de DNA maiores. Bacteriófago λ – 48.502 pares de bases. Clonagem do DNA no Bacteriófago λ é baseado em duas carcaterísticas-chave do genoma do genoma do λ: a) um terço do genoma não é essencial e pode ser substituído pelo DNA estranho b) o DNA será empacotado em partículas do fago infecciosas, apenas se possuírem entre 40.000 e 50.000 pares de bases de comprimento. Utilizados para clonar fragmentos de DNA até 23.000 pares de bases.

Cosmídios : plasmídios recombinantes com características úteis tanto dos plasmídios quanto do bacteriófago λ. Cosmídios – são moléculas de DNA circulares pequenas (5.000 a 7.000 pares de bases), que contém: a) uma origem plasmidial de replicação; b) um ou mais marcadores de seleção; c) um certo número de sítios únicos de restrição onde o DNA estranho pode ser inserido e; d) um sítio cos (seqüência de DNA do bacteriófago λ). Utilizados para clonar fragmentos de DNA até 45.000 pares de bases.

Vetores de clonagem PORQUE CONSTRUIR UMA MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE? -         ESTUDO DA ESTRUTURA DOS GENES -         DIAGNÓSTICO CLÍNICO -         TERAPIA GÊNICA -         MELHORAMENTO ANIMAL E VEGETAL -         OBTENÇÃO DE GRANDES QUANTIDADES DE PROTEÍNAS RARAS. - CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE GENES 

Isolamento de um gene específico Como exemplo – gene humano

Quanto maior o número de fragmentos ou clones produzidos, mais difícil será encontrar o clone com o gene de interesse. BANCOS GENÔMICOS DE ORGANISMOS COMPLEXOS (P. EX. HOMEM), DEVEM SER CONSTRUÍDOS COM FRAGMENTOS DE DNA NÃO MUITO PEQUENOS. BANCO CROMOSSÔMICO - Banco genômico para cada cromossomo. CROMOSSOMOS - são isolados por fluorescência.

6. Problemas Envolvidos na Clonagem do Gene Endonucleases de restrição – podem cortar e destruir os genes a serem clonados. Também mais que um gene pode estar envolvido na expressão de uma característica. Inserção incorreta do gene doador no plasmídio vetor – resultando na falha da bactéria em expressar o gene. A proteína sintetizada pode estar dentro da célula como agregados grandes e insolúveis – ocorrem dificuldades no isolamento da proteína. Pode ocorrer síntese em excesso do produto do gene – às vezes pode ser letal para a bactéria.

DNA recombinante Uso de enzimas bacterianas conhecidas como enzimas de restrição; As enzimas de restrição são altamente específicas; Corta o DNA apenas nos locais onde existem certas seqüências de bases nitrogenadas.

Enzimas de restrição Importância: Foi empregada no Projeto Genoma Humano; É empregado em laboratórios de Genética molecular

P.G.H. Objetivos: Mapeamento genético; Determinar a seqüência de bases de todos os genes de nossa espécie. Curiosidade: O número total de genes apresentado pelo projeto foi de 30 a 31 mil

P.G.H. Perspectivas: Cura de doenças por substituição de genes anormais; Questão da Bioética (uso para o bem comum e não por interesses individuais).

Eletroforese É uma técnica que separa moléculas DNA, RNA e proteínas de acordo com seu tamanho e carga elétrica; Velocidade de migração através de um suporte de material gelatinoso (gel de agarose), submetido a um campo elétrico.

DNA tem carga geral negativa; Migração inversamente proporcional ao tamanho

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) É uma técnica para amplificar pedaços de DNA por meio de uma reação em cadeia utilizando enzimas Muitos técnicas de manipulação de DNA requerem muita amostra de DNA e que este esteja puro

PCR Algumas aplicações: Diagnóstico de doenças genéticas; Detecção de infecções; Monitoração de terapia contra o câncer; Sequenciamento de DNA; Fingerprinting forense.

Nanotecnologia É a utilização de partículas que são medidos na ordem de nanômetros em várias ciências; Richard Feynman.

Nanobiotecnologia Aplicação na Biologia; Perspectivas: superfícies nanofabricadas com padrões estruturais poderiam fazer crescer artificialmente ilhas pancreáticas e reverter os efeitos da diabetes;

Nanobiotecnologia nanodispositivos poderiam funcionar como kits de reparo de neurônios para pessoas com mal de Parkinson ou doença de Alzheimer; destruir vírus ou células cancerosas; descoberta acelerada de drogas, com menor custo