Usando o Código Genético Capítulo 7 Usando o Código Genético

7.1 - Introdução Códons – trios de nucleotídeos organizados do 5’ para o 3’. Correspondem à seqüência de aminoácidos do N-terminal para o C-terminal Estudo do código: Uso de ácido poliuridílico (poliU) polifenilalanina Uso de um trinucleotídeo, que se liga ao ribossomo e a um tRNA.

7.1 - Introdução Há mais códons (61) do que aminoácidos Códons representando o mesmo ou aminoácidos similares tendem a ter seqüência similar Normalmente a terceira base não é significante. Algumas vezes distingue-se purina de pirimidina.

Reações adicionais são permitidas na terceira base 7.1 - Introdução O pareamento dos trinucleotídeos é potencializado pelo ambiente do sítio A ribossomal Reações adicionais são permitidas na terceira base Um mesmo tRNA pode reconhecer mais de um cédon

Aminoácidos similares 7.1 - Introdução Aminoácidos similares Códons similares Efeitos de mutações são diminuídos

7.1 - Introdução Estabelecimento no começo da evolução Universalidade do código Pequeno número de códons representava pequeno número de aminoácidos Códons mais específicos e maior número de aminoácidos Há exceções para o código universal

7.2 – Reconhecimento códon-anticódon Há sete pares de códons onde o significado é o mesmo independente de qual pirimidina está na terceira posição Há 8 famílias de códons onde códons que tenham as duas primeiras bases têm o mesmo significado. Há três casos em que uma base na terceira posição dá um significado único para um códon: AUG – metionina UGG – triptofano UGA - terminação Há cinco pares de códons a purina na terceira posição não altera o aminoácido

7.2 – Reconhecimento códon-anticódon 1º 2º 3º Códon 5’ C A U 3’ Anticódon 3’ G U A 5’ 3º 2º 1º

7.2 – Reconhecimento códon-anticódon A base na primeira posição do anticódon pode parear com mais de uma base Normalmente um tRNA reconhece mais de um códon Isso é chamado de wobbling, e ocorre porque a conformação do arco do anticódon dá flexibilidade à primeira base do anticódon

7.2 – Reconhecimento códon-anticódon É possível distinguir códons únicos apenas quando G e U estão na terceira posição

7.3 – tRNAs são feitos a partir de precursores maiores O CCA é adicionado como um processo meramente enzimático Quando um tRNA não é propriamente processado ele é degradado por um sistema de controe de qualidade. tRNAs são sintetizados como cadeias precursoras com material adicional nos dois lados O fim 5’ é gerado pela clivagem de uma enzima chamada ribonuclease P O fim 3’ começa a ser degradado por uma endonuclease que cliva o precursor. A essa seguem várias exonucleases que degradam no sentido 3’ – 5’.

7.4 tRNAs contém bases modificadas tRNAs contém mais de 50 bases modificadas. Modificações a partir das bases A, G, C, U. mRNAs e rRNAs também sofrem modificações de base, mas as alterações dos RNAs transportadores são mais acentuadas. Modificações: metilação, reestruturação do anel...

7.4 tRNAs contém bases modificadas Regiões com bases modificadas: resíduos D  braço D ψ  seqüência TψC Outras modificações específicas para diferentes grupos: bactérias, leveduras, mamíferos, etc.

7.4 tRNAs contém bases modificadas As enzimas modificadoras de tRNA variam amplamente em tipos e especificidade dentre os diferentes grupos de organismo. aparatos enzimáticos diferentes  conjuntos de tRNAs diferentes

7.5 Bases modificadas afetam o pareamento anticodon-codon Modificações de base em quaisquer partes do tRNA afetam sua especificidade. Quando as bases do anticodon são modificadas, tem-se novos padrões de pareamento entre as diferentes bases criadas e as bases A, C, U e G.

7.5 Bases modificadas afetam o pareamento anticodon-codon Inosina(I) pode ser pareada com A, C e U Assim, a existência de I no anticodon de um tRNA permite o reconhecimento de codons de aminoácidos diferentes. Degeneração do código genético

7.5 Bases modificadas afetam o pareamento anticodon-codon Padrões de modificação: Inosina, geralmente, é originada de Adenina. A primeira Uridina do anticodon, geralmente, tem suas propriedades de pareamento alteradas.

7.5 Bases modificadas afetam o pareamento anticodon-codon Modificações criam leituras preferenciais de alguns codons Codons utilizados freqüentemente tendem a serem lidos de modo mais eficiente

7.5 Bases modificadas afetam o pareamento anticodon-codon Padrões de modificação diferentes  diferentes famílias de tRNAs dentre os organismos.

LGCM URLGA 7.6- Há alterações esporáticas no código universal Tipos de mudanças que podem ocorrer no código genético bacteriano ou no genoma nuclear de eucariotos: 1) Xaa Yaa Ex: CUG Leu Ser Não é comum mudança de um aminoácido para outro. Esta mudança sofre uma forte seleção negativa. 2) Códon de terminação aa Ex: UGA Stop Trp, Cys, Sel Maioria das mudanças são deste tipo, pois não há troca de aminoácido. É necessário modificações no tRNA e nos fatores de terminação para que essa mudança possa acontecer. LGCM URLGA

aa nenhum Ex:AGA Arg nenhum Todas as mudanças são esporáticas. Fig. 7.10

Devido as mitocôndrias sintetizarem um pequeno número de proteínas mudanças no seu código genético não seriam fortemente selecionadas. Fig.7.11 A variedade de mudanças encontradas nas mitocôndrias de diferentes espécies sugerem que essas ocorreram separadamente e não em um descendente comum de um código mitocondrial ancestral.

7.7 Novos aminoácidos podem ser inseridos no lugar de alguns códons de terminação 1- UGA seleno-cisteínas Ocorrência: procariotos e eucariotos Condições para ocorrer: Presença de seleno-cys-tRNA Estrutura em forma de loop após o códon UGA Fig.7.12 2- UAG pyrrolysine Ocorrência: archaea e bactérias

7.8- tRNA são modificados com aminoácido por sintetases Fig. 7.13 1º aa reage com ATP, formando aminoacil-AMP e liberando pirofosfato 2° aa ativado é transferido para o tRNA, liberando AMP Há 20 tipos de tRNA

7.9 Aminoacyl.tRNA synthetases fall into two groups Grande variedade de enzimas: Subunidades de 40-100 kD; Monoméricas, diméricas ou tetraméricas. Separação em dois grupos: De acordo com a estrutura do domínio que contém o sítio ativo Domínio catalítico: sítios de ligação para o ATP e aminoácido; Interrompido por um domínio de ligação à hélice aceptora do tRNA Domínio de ligação a região do anticódon do tRNA; Enzimas multiméricas possuem o domíno de formação do oligômero.

Variável (depende da enzima) N.terminal C-terminal Fig. 7.14 – Aminoacil-tRNA sintetase Variável (depende da enzima) Folhas- e -hélices.

Fig. 7.15 – Aminoacil-tRNA sintetase (estrutura cristalina) Especula-se que as sintetases ligam-se aos tRNAs pela lateral em L da molécula, principalmente pelas extremidades e que a maior parte da sequência do tRNA não é reconhecida pela enzima.

Ligações de hidrogênio (proteína-tRNA) Fig. 7.16 – tRNA sintetase classe I. Fig. 7.17 – tRNA sintetase classe II. O contato com a enzima altera a estrutura do tRNA

7.10 Synthetases use proofreading to improve accuracy Cada sintetase deve ser capaz de distinguir 1 entre 20 aminoácidos e associar-se a 1 tRNA (1-3) em um grupo de cerca de 100 tRNAs. É especialmente difícil distinguir aminoácidos que diferem entre si apenas pelo tamanho da cadeia de carbono A discriminação entre tRNAs é mais fácil já que eles oferecem uma maior superfície de contato. A especificidade de reconhecimento tanto de aminoácidos quanto de tRNAs é controlada pelas aminoacil-tRNA sintetases por reações de prova de leitura que revertem as reações de catálise se um componente incorreto for incorporado.

As reações de ligação de aminoácidos e tRNAs ocorrem em vários estágios, sendo que os passos evoluem somente se os substratos corretos estiverem ligados à enzima. Como? tRNA se liga ao sítio ativo da enzima tRNA correto tRNA incorreto Mudança conformacional Aminoacilação Fig. 7.18 –Reconhecimento do tRNA pela sintetase.

A especificidade por aminoácidos varia de acordo com a enzima. Algumas enzimas são altamente específicas para a ativação dos aminoácidos enquanto outras não. Quando a sintetase liga um aminoácido incorreto, a revisão requer a ligação do tRNA correto. Pode ocorrer uma mudança conformacional que causa a hidrólise do aminoacil-adenilato incorreto ou então uma transferência do aminoácido para o tRNA, seguido de hidrólise. Fig. 7.19 –Reconhecimento do tRNA pela sintetase.

Discriminação entre aminoácidos dependente de tRNA em E. coli Exemplo: Discriminação entre aminoácidos dependente de tRNA em E. coli Ile-tRNA sintetase pode ligar valina com AMP, mas hidrolisa o valil-adenilato quando tRNAIle é ligado. A taxa de erro global depende da especificidade de passos individuais. 1,5 x 10-5 Taxa bem menor que a de substituição de valina por isoleucina. Isto significa que erros de ligação de aminoácidos são responsáveis por uma fração muito pequena dos erros que na verdade ocorrem durante a síntese protéica.

Ile-tRNA sintetase usa o tamanho como forma de discriminação entre os aminoácidos. Sítio de hidrólise Sítio de ativação Fig. 7.21- Sítios ativos da Ile-tRNA sintetase. O aminoácido é tranportado do sítio de ativação para o de hidrólise da Ile-tRNA sintetase por uma mudança de conformação do tRNA. Fig. 7.22 – Ile-tRNA sintetase.

Reconhecendo-o como o códon original 7.11 - tRNAs supressores Possuem uma mutação no anticódon que altera o códon ao qual esse tRNA responde. tRNAs supressores revertem o efeito de códons mutados Reconhecendo-o como o códon original Restaurando a função protéica

tRNAs supressores Nonsense Missense

7.12 – Existem supressores nonsense para cada códon de terminação Os supressores nonsense são divididos em 3 classes, uma para cada tipo de códon de terminação. Supressores âmbar Reconhecem UAG Supressor UGA Seqüência do anticódon não muda Mutação permite o pareamento não usual de C com A Supressores ocre Reconhecem UAA ou UAG

O pareamento códon-anticódon tanto de tRNAs selvagens quanto de mutantes não pode ser predito inteiramente da seqüência tripla relevante, mas é influenciado por outras características da molécula.

Aminoácido particular 7.13 – Supressores competem com tRNA selvagem Célula selvagem Célula com mutação supressora Códon mutante Códon tRNA supressor Significado usual Aminoácido particular Sinal de terminação Competição

Extensão dessa competição vai influenciar a eficiência da supressão Eficiência de um supressor vai depender: - Afinidade entre seu anticodon e o codon alvo; - Concentração na célula A eficiência de leitura de um códon é influenciada pela sua localização Bases vizinhas ao códon podem mudar a freqüência com a qual um códon é reconhecido por um tRNA particular

Supressão nonsnese de terminações naturais Proteínas alteradas

Supressores nonsense serão mais eficientes, quando o codon de terminação reconhecido por ele for relativamente infreqüente no sistema em questão Supressores âmbar em E. coli – códon (UAG) pouco frequente – 10-50% de eficiência Supressores ocre – códon (UAA) usado mais frequentemente – eficiência abaixo de 10% UGA – lido pelo Trp-tRNA com freqüência de 1 a 3% - usado mais comumente que o códon âmbar nos sistemas bacterianos

Supressores missense Dilema para a célula: suprimir o que é um códon mutante em um lugar e não alterar extensivamente seu significado normal em outros lugares Mutações de uma cópia de um grupo redundante de tRNA Não elimina o reconhecimento dos códons usuais

7.14 – O ribossomo influencia a precisão da tradução A falta de variações detectáveis quando a sequência de uma proteína é analisada demonstra que a síntese proteica é bem precisa. Os poucos erros ocorrem como substituições de um aminoácido por outro. Existem dois estágios na síntese proteica onde erros podem aparecer: 1- ligação do t-RNA com o aminoácido correto 2- reconhecimento códon-anticódon

Existem dois modelos básicos para explicar como o ribossomo discrimina entre pareamento correto ou incorreto entre aminoacil-tRNA: 1- A estrutura do ribossomo reconhece aminoacil-tRNAs que paream corretamente. Ou seja, o pareamento correto leva a pequenas mudanças conformacionais que possibilitam a tradução. 2- Existiria dois estágios nesse processo, assim o aminoacil-tRNA teria várias oportunidades de se desligar do ribossomo. Um pareamento errôneo impediria a passagem de um estado para o outro.

O modelo atual incorpora elementos dos dois outros modelos propostos:

7.15 – Recoding changes codon meanings A fase de leitura é geralmente invariável. Começa em AUG e continua em triplets até o códon de terminação. A leitura não reconhece senso. Ou seja, a inserção ou a deleção leva a um “frameshift”. Existem algumas exceções dos padrões de tradução que possibilitam que uma janela de leitura com interrupções – códon sem sentido ou frameshift – possa ser traduzida em uma proteína inteira. Mundando o sentido de um códon permite-se colocar um aminoácido em um códon de terminação, ou inserir um aminoácido no lugar de outro.

Uma mutação em um tRNA (geralmente no anticódon) pode suprimir o sentido original do códon. Em um caso especial, um tRNA específico é acoplado por um fator de elongação para reconhecer um códon de terminação adjacente a um loop em grampo

7.16 Frameshift ocorre em seqüências “escorregadias” Frameshifting está associado com tRNAs específicos: Supressores de tRNAs mutantes reconhecem um códon de 4 bases certas seqüências permitem o tRNA mover-se ao longo do mRNA no sítio A Mutações por frameshift ocorrem pela inserção ou deleção de uma base e podem ser suprimidas restaurando a fase de leitura original O tipo mais simples de supressor de frameshift corrige a fase de leitura quando houve uma inserção em um trecho de bases repetidas

Em fagos e vírus, ocorrem situações em que frameshifting é um evento normal esses eventos podem causar a terminação ou continuação da síntese protéica Ex. tradução em retrovírus

Frameshifting programado ocorre com freqüências 100-1000 x maiores seqüências escorregadias permitem o aminoacil-tRNA mover-se 1 base para frente ou para trás o ribossomo é atrasado para permitir o rearranjo

7.17 Ultrapassagem envolve movimentação do ribossomo Algumas seqüências promovem evento de ultrapassagem evento mais raro, apenas 3 exemplos (Ex.: gene60 do fago T4) códons idênticos nas extremidades da seqüência omitida

Também depende de pausa do ribossomo maior probabilidade de dissociação do peptidil-tRNA quando há atraso na entrada de aminoacil-tRNA Gene 60 do fago T4: estrutura do mRNA reduz eficiência da terminação