PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA PARA TRIAGEM DE PROMOTORES UTILIZANDO GENES REPÓRTERES DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES EM Saccharomyces cerevisiae Elizabeth dos Reis Mazoni Andrade Orientadora: Dra. Mônica Bucciarelli Rodriguez Belo Horizonte Departamento de Biologia Geral Instituto de Ciências Biológicas 2002

Métodos para Análise da Expressão Gênica Investigação da Expressão Gênica Sequenciamento completo - 1996 LEVEDURAS Métodos para Análise da Expressão Gênica Microarranjos de DNA Exposição diferenciada Análise Seriada da Expressão Gênica Genes Repórteres

PROMOTORES Estrutura de promotores Promotores transcritos por RNA polimerase II: Estrutura de promotores Elementos básicos: PIC (TATA box), Inr, DPE Elementos regulatórios: UAS, URS, poly(dA-dT) HSF POL II HSP82 TATAAA HSE1 HSE2 HSE3 TFIIF TBP TFIIA TFIIB TFIIE TAFs

FUSÃO GÊNICA Fusão transcricional Fusão traducional Gene Repórter Promotor Fusão traducional Gene Repórter Promotor Met

LacZ GENES REPÓRTERES Beta-galactosidase Escherichia coli

GFP EGFP yEGFP Aequorea victoria Otimização de códons Ser-65 THr Phe-64 Leu yEGFP Otimização de códons

Discosoma sp. DsRed

SISTEMA REGULADO POR TETRACICLINA Promotor tetO-CYC1/tetR-VP16/lacZ tetR VP16ad tet07 CYC TATA lacZ tTAtransativator 7 Tet0 box lacZ TRP1 Apr pCM173 10683 bp

SISTEMA SEM TETRACICLINA VP16ad tetR VP16ad tet07 CYC TATA lacZ

SISTEMA COM TETRACICLINA VP16ad tet07 CYC TATA lacZ

Sistema de triagem de promotores em Saccharomyces cerevisiae

Vetor para a biblioteca

Caracterização dos Genes Repórteres Avaliação da meia vida de genes repórteres Sistema regulado por tetraciclina

Determinação da meia vida da expressão de lacZ

Fase exponencial de crescimento Fase estacionária de crescimento

Fase exponencial de crescimento Fase estacionária de crescimento

Avaliação do efeito do bloqueio da tradução sobre a atividade proteolítica

Fase exponencial de crescimento Fase estacionária de crescimento

Avaliação da meia vida da expressão de proteínas fluorescentes

Construção dos plasmídios com as proteínas fluorescentes yEGFP pCM173-yEGFP y EGFP pCM173-EGFP Construção dos plasmídios com as proteínas fluorescentes DsRed pCM173-DsRed

DsRed

EGFP

yEGFP

Número de células fluorescentes de acordo com a fase de crescimento da levedura

Avaliação da expressão de lacZ utilizando MUG como substrato

Fase estacionária Fase exponencial

Aspectos da utilização de genes de proteínas fluorescentes como repórteres para a triagem de promotores

ESTABILIDADE MATURAÇÃO

Visualização da produção de beta-galactosidase de acordo com o tempo

Experimentos utilizando meio SD Número de células Número de células viáveis Unidades de beta-gal Experimentos utilizando meio SD Experimentos utilizando meio SD drop-out

CONCLUSÕES

O uso do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter lacZ para visualização da meia vida da expressão de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae se mostrou viável para beta-galactosidase e pode ser utilizado para basicamente qualquer proteína em levedura. A utilização do sistema de bloqueio geral da tradução para visualização da meia vida de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae fornece um resultado mais longo que o real, devido ao bloqueio da tradução de proteínas proteolíticas. O uso de repórteres para triagem de promotores em diferentes fases de crescimento da levedura deve levar em conta que a meia vida do fenótipo é diferente. Existe uma regulação, durante as fases de crescimento da levedura, do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter A presença de atividade detectável do gene repórter em apenas uma parcela das células albergando o sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter, é uma característica própria deste sistema

AGRADECIMENTOS